Wnt/β-catenin信號轉導通路與腦缺血后細胞凋亡

王正遠 綜述 韓江全 審校

(遵義醫學院第五附屬(珠海)醫院，廣東 珠海 519100)

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Wnt/β-catenin信號轉導通路與腦缺血后細胞凋亡

王正遠 綜述 韓江全△審校

(遵義醫學院第五附屬(珠海)醫院，廣東 珠海 519100)

Wnt； β-鏈蛋白； 糖原合成酶激酶-3β； 腦缺血； 細胞凋亡

腦缺血損傷機制極為復雜，炎癥、氧化應激以及凋亡各種損傷因素均與缺血性腦損傷及損傷擴大的過程相關。由于細胞凋亡主要發生在梗死區周圍的缺血半暗帶區，凋亡神經元的多寡直接決定著神經元壞死數量和梗死區域的面積，因此，細胞凋亡在腦缺血損傷中起著重要作用，及時有效的抗凋亡措施，有望成為缺血性卒中的有效治療方法[1]。信號轉導通路在細胞凋亡中扮演著關鍵的角色。研究表明，腦缺血后，與凋亡有關的信號轉導通路主要包括磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(Akt)信號通路，Wnt/β-catenin信號通路等。其中，Wnt/β-catenin為抑制細胞凋亡和促進細胞存活的重要信號轉導通路[2-3]，而作為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)下游的重要蛋白，GSK-3β在腦缺血中發揮著促凋亡作用[4-5]。

1 Wnt/β-catenin信號轉導通路的重要原件和功能

1.1 Wnt及其功能 Wnt是一個復雜的大家族。Wnt基因編碼的蛋白為分泌型糖蛋白，一般情況下長度在350-400個氨基酸，Wnt蛋白是指Wnt信號通路中的配體蛋白，其可與細胞膜上的相應受體結合，進而激活各級傳導分子，最終調控下游靶基因的轉錄與翻譯[6]。哺乳動物體內的19種Wnt蛋白被分成Wnt1組和Wnt5a組兩大類，Wnt1組有Wnt1、Wnt3、Wnt10等以Wnt/β-catenin信號通路(也稱為經典Wnt信號通路)傳遞分子信息，Wnt5a組包括Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a等，以非依賴β-catenin信號通路(也稱為非經典Wnt信號通路)傳導傳遞分子信息[7]。

1.2 β-catenin及其功能 β-catenin是Wnt/β-catenin信號轉導通路中起關鍵作用的一種蛋白質，β-catenin蛋白由781個氨基酸組成，分子量約為90KD，其肽鏈中部有12～14個各由42個氨基酸殘基組成的重復序列(稱arm區域)，該區域可以和E-cadherin、APC蛋白、TCF、上皮生長因子(EGFR)等蛋白結合而發揮多種功能。β-catenin的氨基末端有數個GSK-3β和酪氨酸蛋白激酶的磷酸化位點。這些位點的磷酸化與去磷酸化。對β-catenin的功能轉換起重要調控作用。[8]

1.3 Wnt/β-catenin信號通路 未受到刺激的情況下，細胞內Wnt信號幾乎不表達。在各種原因導致Wnt蛋白表達增加時，Wnt信號通路活化，Wnt蛋白結合到Frizzled蛋白(跨膜受體卷曲蛋白)和輔助受體LRP5/6(低密度脂蛋白受體家族)后，活化細胞內Dvl蛋白(散亂蛋白，Dishevelled)，Dvl蛋白的活化抑制了細胞質內由糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、APC、軸蛋白(Axin)等組成的復合物的活性，導致未磷酸化的β-catenin在細胞內聚集并轉移到細胞核內，并與轉錄因子TCF/LEF相結合形成復合物，引起轉錄激活，促進細胞保護性靶蛋白分子如survivin、Bcl-2、血管內皮生長因子( VEGF ) 等的轉錄表達[9]以及維持細胞的 DNA 完整性及細胞膜磷脂分子的極性，從而發揮阻止細胞凋亡、促進細胞再生的功能，在各器官組織中維持其內環境穩定等的保護功能。總之，Wnt是細胞內的重要蛋白分子，與神經細胞的發育、存活、凋亡以及神經系統腫瘤的發生等多種生物學事件有關。DKK-1作為Wnt通路重要拮抗劑，在局灶性腦缺血模型中廣泛誘導[3]。DKK-1可以競爭性結合LRP5/6，此外DKK-1還可以與Kremen、LRP5/6形成三聚體，導致快速內吞而減少質膜上的LRP5/6從而阻止Wnt-Frizzled復合物形成，最終β-catenin被磷酸化而不能與核內LEF/TCF結合，從而抑制下游基因表達。

2 GSK-3β信號轉導通路

2.1 GSK-3β及其功能 哺乳動物GSK-3包括2種亞型-GSK-3α和GSK-3β，二者的激酶結構序列幾乎一致，主要不同點在于其N-末端與C-末端。GSK-3α廣泛分布于真核細胞，GSK-3β則選擇性表達于中樞神經系統，因此該亞型與腦內功能高度相關。GSK-3β通常在預磷酸化的底物下被磷酸化的。GSK-3β通過位于激酶端的酪氨酸殘基216(Tyr216)磷酸化而激活，通過氨基末端的絲氨酸殘基9(Ser-9)的磷酸化而抑制。GSK-3β參與許多細胞過程，包括胰島素和Wnt/wingless信號通路。

2.2 PTEN/PI3K/Akt/GSK-3β信號通路 GSK-3β的活性通過胰島素信號的調節而減弱。具體而言，胰島素可激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)，一方面增加抗凋亡蛋白的表達，另一方面抑制促凋亡蛋白的活性。PI3K通過磷酸化方式激活下游靶蛋白Akt/蛋白激酶B。磷酸化Akt(pAkt)緊接著磷酸化并抑制GSK-3β。然而，當應激時，細胞死亡是誘導和激活磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)，細胞內一個3’-磷酸酶，依次傳遞給PI(3,4)P2，PI(4)P， PI(3,4,5)P3 ，PI(4,5)P2，同時激活的PTEN通過抑制PI(3,4,5)P3抑制PI3K。失活的PI3K不能磷酸化Akt,同時pAkt的減少降低了GSK-3β的磷酸化，所有這些使GSK-3β活化[10-11]。激活的GSK-3β抑制熱休克轉錄因子-1(HSTF-1),導致線粒體死亡途徑，細胞色素C從線粒體釋放。最后，釋放的線粒體通過激活caspase-9和caspase-3導致細胞凋亡[12]。

2.3 GSK-3β和線粒體內源性凋亡途徑 線粒體集成不同的信號通路，參與多個細胞過程，包括細胞凋亡。線粒體最主要的特征是在活細胞中，維持膜電位和線粒體通透性轉換孔的低電導狀態(mPTP)。mPTP的激活是線粒體介導內源性細胞凋亡的中心事件[13]。細胞死亡的mmPTP途徑是通過線粒體膜的破壞和凋亡相關分子的釋放介導的，這可以通過GSK-3β信號通路調節mPTP的開放。GSK-3β對細胞死亡和生存與它控制許多蛋白的線粒體定位和激活有關，尤其是B細胞淋巴瘤2(Bcl-2)家族蛋白，包括Bax，Bcl-2和Mcl-1，在mPTP形成中有重要地位[14]。通常而言，Bax作為胞漿蛋白，在凋亡信號刺激下，轉運到線粒體膜上。一旦位于線粒體膜，Bax可以螯合Bcl-2并在線粒體膜上聚合，導致促凋亡分子釋放到細胞質中。相反地，Bcl-2和Mcl-1作為抗凋亡成員，保護線粒體膜的完整性，從而阻止抗凋亡分子的釋放和細胞凋亡的發生。GSK-3β的激活通過上調Bax表達水平促進線粒體介導的凋亡。鋰鹽治療，作為GSK-3β的藥源性抑制劑，可以通過降低Bax表達水平，抑制促凋亡通路，而通過提高Bcl-2表達促進抗凋亡通路[15]。此外，GSK-3β可以通過直接磷酸化BAX蛋白的Ser163位點促進該蛋白的線粒體定位[16]。 GSK-3β磷酸化Mcl-1的Ser159位點，導致這種蛋白的失衡，以至于封堵Mcl-1，使得其不能結合到線粒體膜上。總而言之，GSK-3β通過線粒體凋亡途徑，在控制細胞死亡和生存上占有重要的地位。

3 Wnt/β-catenin通路與腦缺血后神經元凋亡

腦缺血刺激下會打破生理狀態下Wnt/β-ctenin和GSK-3β通路轉導信號的平衡，導致神經元凋亡。

3.1 Wnt/β-catenin信號通路與腦缺血再灌注損傷 學者L.Doubravska等[17]發現初級海馬神經元Wnt1瞬時過表達以及重組Wnt1蛋白的注射，都可以使初級海馬神經元及大腦皮層免受氧化應激損傷。早期的研究發現，與淋巴細胞共培養的成纖維細胞過表達Wnt1能使淋巴細胞免于凋亡。

3.2 GSK-3β與腦缺血再灌注損傷 S.Kelly[18]等學者利用GSK-3β選擇性抑制劑Chir025研究發現，GSK-3β活性降低能使神經元免受糖氧剝離損害,谷氨酸毒性以及腦缺血損害。

4 神經保護干預因素的作用機制與Wnt/GSK-3β/β-catenin信號通路

Q.G.Zhang[19]等的研究表明，腦缺血時給予保護性干預藥物如雌激素會減少DKK-1的生成，提高Wnt/β-catenin信號通路的活性，增加終產物β-catenin的含量。Y.Xing[20]等的研究表明，神經保護劑舒林酸能活化Wnt/β-catenin信號通路，高劑量的舒林酸可使p-β-catenin表達降低，促凋亡蛋白BAX表達下降，抗凋亡蛋白Bcl-2表達升高，減輕腦水腫及腦梗死體積。

5 展 望

Wnt/β-catenin信號通路具有明確的抗凋亡作用，其激活劑不斷深入研究，為腦血管病治療提供新的靶點。GSK-3β即可以為Wnt/β-catenin通路的一部分，也可通過Akt/GSK-3β、胰島素/GSK-3β發揮作用，GSK-3β抑制劑的研究也為腦血管病治療提供新的靶點。目前，關于Wnt/β-catenin及GSK-3β的研究多集中在缺血再灌注損傷方面，對于超負荷血糖對鼠腦缺血再灌注后神經細胞凋亡的研究較少。韓江全[21]等研究表明上調FADD、Daxx表達，促進細胞凋亡可能是超負荷血糖加重腦缺血再灌注損傷的機制之一。Fas相關死亡域蛋白(fas-associated with death domain protein，FADD)是死亡受體介導的凋亡途徑關鍵的啟動子，在細胞凋亡中起著極為重要的作用[22]。死亡域相關蛋白(death domain associated protein，Daxx)是一種多功能的核蛋白，可多途徑的促進細胞凋亡[23]，Wnt/β-catenin信號通路與FADD及DaXX在超負荷血糖加重腦缺血再灌注損傷關系有待進一步研究。

[1] Mehta SL, Manhas N, Raghubir R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics[J].Brain Res Rev, 2007, 54 (1): 342-661

[2] Lei ZN, Zhang LM, Sun FY. Beta-catenin siRNA inhibits ischemia induced striatal neurogenesis in adult rat brain following a transient middle cerebral artery occlusion[J]. Neurosci Lett, 2008, 435(2)：108-112.

[3] Mastroiacovo F，Busceti CL，Biagioni F，et a1．Induction of the Wnt antagonist，Dickkopf-1，contributes to the development of neuronal death in models of brain focal ischemia[J].J Cereb Blood Flow Metab，2009,29(2):264-276.

[4] Endo H, Nito C, Kamada H, et al. Activation of the Akt/GSK3β signaling pathway mediates survival of vulnerable hippocampal neurons after transient global cerebral ischemia in rats[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2006, 26: 1479-1489.

[5] Zhao H, Shimohata T, Wang JQ, et al. Akt contributes to neuroprotection by hypothemia against cerebral ischema in rats[J]. J Neurosci,2005,25: 9794-9806.

[6] Angers S，Moon RT．Proximal events in Wnt signal transduction[J]．Nat Rev Mol Cell Biol，2009，10(7)：468-477．

[7] Baksh D，Boland GM，Tuan RS．Cross-talk between Wnt signaling pathways in human mesenchymal stem cells leads to functional antagonism during osteogenic differentiation[J]．J Cell Biochem，2007，101(5)：1109-1124．

[8] Peifer M,Polakis P. Wnt signaling in oncogenesis and embryogenesis-a look outside the nucleus.[J].Science,2000,287(5458)：1606.

[9] Liebner S, Corada M，Bangsow T．Wnt/beta-catenin signaling controls development of the blood-brain barrier[J]．J Cell Biol，2008,183(3):409-417.

[10] Watcharasit P, Bijur GN, Song L, et al. Glycogen synthase kinase-3beta (GSK3beta) binds to and promotes the actions of p53[J]. Journal of Biological Chemistry,2003,278(49):48872-48879.

[11] Bijur GN, Jope RS. Opposing actions of phosphatidylinositol 3-kinase and glycogen synthase kinase-3β in the regulation of HSF-1 activity[J].Journal of Neurochemistry,2000,75(6):2401-2408.

[12] Cantley LC. The phosphoinositide 3-kinase pathway[J].Science,2002,296(5573):1655-1657.

[13] Perier C, Tieu K, Guegan C, et al.Complex I deficiency primes Bax-dependent neuronal apoptosis through mitochondrial oxidative damage[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2005，102:19126-19131.

[14] Linseman DA, Butts BD, Precht TA, et al.Glycogen synthase kinase-3beta phosphorylates Bax and promotes its mitochondrial localization during neuronal apoptosis[J]. J Neurosci，2004，24:9993-10002.

[15] Chen G, Zeng WZ, Yuan PX, et al.The mood-stabilizing agents lithium and valproate robustly increase the levels of the neuroprotective protein bcl-2 in the CNS[J]. J Neurochem,1999,72:879-882.

[16] Linseman DA, Butts BD, Precht TA, et al.Glycogen synthase kinase-3beta phosphorylates Bax and promotes its mitochondrial localization during neuronal apoptosis[J]. J Neurosci,2004,24:9993-10002.

[17] Doubravska L, Simova S, Cermak L,et al. Wnt-expressing rat embryonic fibroblasts suppress Apo2L/TRAIL-induced apoptosis of human leukemia cells[J]. Apoptosis,2008,13:573-87.

[18] Kelly S，Zhao H，Hua Sun G，et a1．Glycogen synthase kinase-3beta inhibitor Chir025 reduces neuronal death resulting from oxygen-glucose deprivation，glutamate excitotoxicity，and cerebral ischemia[J]．Exp Neurol，2004，188(2)：378-386．

[19] Zhang QG，Wang R，Khan M，et a1．Role of Dickkopf-1，an antagonist of the Wnt/beta-catenin signaling pathway， in estrogen-induced neuroprotection and attenuation of tau phosphorylation[J]．J Neurosci，2008，28：8430,8441

[20] Xing Y ,,Zhang X, Zhao K,et al.Beneficial effects of sulindac in focal cerebral ischemia：A positive role in Wnt/β-catenin pathway[J]. Brain Res,2012,30:71-80.

[21] 韓江全，吳俊雄，胡泳濤,等.超負荷血糖對鼠腦缺血再灌注后神經細胞凋亡及FADD、Daxx表達的影響[J].貴州醫藥.2012,3(36)：195-200.

[22] Chinnaiyan AM，O’Rourke K，Tewari M，et a1．FADD，a novel death domain-containing protein，interacts withthe death domain of Fas and initiates apoptosis[J]．Cell，1995，81：505-512．

[23] Yang X，Khosravi-Far R，Chang HY，et al．Daxx，a novel Fas-binding protein that activates JNK and apoptosis[J]．Cell，1997，89：1067-1076．

貴州省衛生計生委科學技術基金項目(gzwjkj2014-2-157)；珠海市重點學科項目(珠衛2013070)

R743.3

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