循環腫瘤細胞檢測技術研究進展

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循環腫瘤細胞檢測技術研究進展

張國瑞1張忠獻2曹風雨2劉紅1楊曉樂1張業鵬1

(1.鄭州大學第一附屬醫院 呼吸與危重癥二科二病區河南 鄭州450052； 2.鄭州大學 基礎醫學院河南 鄭州450001)

【關鍵詞】循環腫瘤細胞；檢測；腫瘤

2015年2月4日，CA期刊在線發布了《2012全球癌癥統計》的全文。基于GLOBOCAN估計，2012年全球有1.41千萬新發癌癥病例，820萬患者死于癌癥。其中57%的癌癥患者以及65%的癌癥死亡患者來自于發展中國家。根據對全國腫瘤登記中心2011年監測數據分析，中國腫瘤登記中心2015年報發布我國當年新增癌癥病例337.2萬，癌癥死亡病例221.3萬，相當于每分鐘就有6.4個人罹患癌癥。其中結直腸癌、男性前列腺癌、女性乳腺癌、甲狀腺癌、宮頸癌發病率持續上升；食管癌、胃癌、肝癌發病率下降，但肺癌發病率和死亡率變化不大。肺癌發病率在我國男性患者中居第1位，在女性患者中居乳腺癌之后，死亡率均居第1位，5年生存率為16.1%，其中因遠處轉移而死亡的患者比例超過90%[1]。

1循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)概述

盡管經典理論認為在病情進展至晚期才會出現惡性腫瘤的轉移和復發，但實際上在早期就已發生了腫瘤細胞的播散。早在1869年，Ashworth在1位因癌癥死亡患者的循環血液中發現一種類似于尸檢組織樣本中發現的腫瘤細胞，CTCs的概念從而被首次提出[1]。目前，CTCs被定義為自發或因診療過程中由實體瘤或轉移灶釋放進入外周血循環的腫瘤細胞。其中多數的腫瘤細胞進入循環系統后將被機體的免疫系統識別并清除，但是少量腫瘤細胞將演進并獲得新的特征，從而在血液中存活，這些細胞即CTCs，甚至于進一步聚集形成微小癌栓—循環腫瘤微栓(circulating tumor microemboli，CTM)，其成分可能包括癌細胞、成纖維細胞、白細胞、內皮細胞及血小板等。相對于單個癌細胞，CTM在一定條件下更容易發展為轉移灶[2]。

CTCs在惡性腫瘤發生發展進程中均可以被檢測到，包括在臨床確診前[3]。近年來關于各種實體瘤的研究和治療技術不斷提高，很多患者在手術等治療后雖未被檢測到殘留的腫瘤病灶，但最終卻因腫瘤復發和轉移而死亡。這可能與臨床判定標準有關，其中最重要的即影像學技術。很多情況下并不能檢測到微小的殘留腫瘤細胞，這些細胞存在于外周血、骨髓中，在一定條件下能夠再次增殖、浸潤，引起腫瘤復發、轉移。同樣，在腫瘤患者早期未形成可被影像學檢測到的可視病灶前，外周循環血液中同樣可發現CTCs的存在。在腫瘤的發生發展過程中檢測CTCs不但有助于早期診斷，監測復發、轉移，而且在治療過程中可根據CTCs的變化判定療效及預后。進一步對CTCs進行分子生物學分析，可以制定個體化的治療方案[4]。尤其需要注意的是，隨著基因組學研究及對腫瘤標志物表達、缺失、差異性表達研究的深入，科學家們發現，由于受腫瘤異質性的影響，臨床組織活檢雖起到確診及指導用藥的目的，但單次組織活檢可能會造成分子標志物分析的偏差，在腫瘤的進展過程中更加明顯，然而實時活檢在臨床上難以被患者接受。因此，通過對CTCs分子特征及突變的分析將會促進更多分子標志物的發現及藥物的開發，對于CTCs單細胞的進一步研究將使我們有可能對腫瘤的生物學行為、疾病進展及轉移過程有更深入的認識[3]。

2CTCs檢測方法

盡管研究人員已經在多種類型的實體瘤患者的外周血中發現CTCs，但CTCs的數量相對來說還是非常稀少的，要在數以百萬計的白細胞中檢測出CTCs，就如同大海撈針一般，并非是件容易的事情。對于CTCs的檢測，目前多數研究建立在富集的基礎上[5]，而對CTCs的富集主要是依據不同種類血細胞的物理特征(如大小、密度、電荷等)及生物學特征(如細胞表面蛋白等)的差異[6]。富集分離方法主要包括以免疫學為基礎的檢測技術、非標記檢測技術、以生物物理特性為基礎的檢測技術等。

2.1以免疫學為基礎的檢測技術免疫學富集技術是通過抗原抗體反應標記細胞從而達到富集作用，在此技術基礎上與免疫磁珠、微流控設備等相結合從而開發出多種檢測系統。免疫磁珠技術是在細胞表面抗原與免疫磁球特異性單抗結合的基礎上，于外加磁場的作用下吸附復合物，達到富集的目的。這是一種使用最普遍的檢測方法。根據標記的靶細胞是否為CTCs分為陽性富集及陰性富集兩大類。陽性富集方法即以免疫方法標記CTCs的方法達到富集檢測的目的。市場上已有多種應用本原理的檢測設備，如CellSearch系統、CTC-Chip、免疫磁性細胞分選儀(MACS)、RARE Cell、Adnatest癌細胞檢測系統等[7]。CellSearch系統是目前惟一被美國食品藥品監督管理署(FDA)批準進入臨床的檢測方法，用于預測轉移性乳腺癌、前列腺癌和結直腸癌的無進展生存時間(progression-free survival，PFS)和總存活時間(overall survival，OS)，通過強力磁體將上皮黏附因子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)陽性的CTCs從血液樣本中富集出來，證明其為上皮來源的細胞，然后通過對細胞角蛋白(cytokeratin，CK)8、CK18、CK19、CD45和DAPI進行免疫熒光染色，證明其為非白細胞及有核細胞，系統掃描分析后篩選CK陽性的細胞供檢測者判讀，符合腫瘤細胞形態且CK+、DAPI+、CD45-的細胞被定義為CTCs。應用該方法發現，非小細胞肺癌患者Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期陽性率分別為36%、45%、40%[8]。盡管CellSearch系統目前被認為是精準度較高的一種檢測方法，但是在炎癥性疾病等非腫瘤疾病患者外周血中可發現假陽性結果的存在，更重要的是該方法的富集效率并不盡如人意。原因不難理解，盡管EpCAM被認為是目前最優的上皮來源腫瘤細胞的特異性抗原，但深入的研究發現，在腫瘤發生轉移前，原發腫瘤細胞通常會在其微環境的影響下經歷一種被稱為上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的改變，不僅細胞形態和移動性改變使其容易釋放及轉移，細胞基因表達譜特別是上皮抗原向間質性表型轉變，此時的癌細胞表面EpCAM往往是不表達的，從而導致以EpCAM為基礎的CellSearch系統富集效率欠佳，加之該檢測費用較高，使其在臨床上廣泛應用受到限制。

Adnatest系統是通過免疫磁珠技術富集CTCs，繼以RT-PCR技術檢測腫瘤細胞特異性表達的mRNA，從而達到檢測CTCs的目的[8-12]。其可對乳腺癌、前列腺癌、結腸癌及卵巢癌患者的CTCs進行基因表達分析。盡管此方法靈敏度較高，但它是建立在這些核酸來源于CTCs的假設的基礎上。另外，由于核酸的半衰期不穩定，檢測到的可能只是游離的核酸而非CTCs，且部分核酸為壞死腫瘤細胞分解所釋放，易于出現假陽性結果，并且無法擺脫核酸檢測技術進行后續分析的缺陷。

微流控技術是一種針對極小量(10-9～10-18L)流體進行操控的系統科學技術，微流控芯片以微流控技術為基礎，使得其容納流體的有效結構(通道、反應室和其他某些功能部件)至少在1個維度上為微米級尺度。近年來，納米技術和微流控技術的結合使得CTCs捕獲效率更高。CTC-chip系統是以微流控設備為基礎，包含包被抗EpCAM抗體的微型柱，在層流的條件下捕捉CTCs[13-14]。Zhang等[15]設計了一種微流體芯片共培養模型，檢測效率達到68%，在富集CTCs的基礎上還可以進行擴增培養，進而進行基因檢測、侵襲實驗、高通量測序等后續研究。一些基于微流控芯片的CTCs分離體系也逐漸被研制出來，比如一種腫瘤細胞表面特異性識別抗體功能的魚骨形芯片(HB-chip)[16]。該芯片通過通道內魚骨形溝回引起血液的一個輕微渦旋，增強抗原與抗體的接觸。相對于CellSearch檢測系統，該技術無需對血液樣品進行預處理且靈敏度高。另外，將微流控與免疫磁珠相結合的檢測技術還有Ephseia[17]、isoFlux(Fluxion)[18]、LiquidBiopsy(Cynvenio)[19]等。

流式細胞技術(flow cytometry，FCM)是利用流式細胞儀進行的一種單細胞定量分析和分選技術。ImageStream(Amnis)系統首先將熒光特異性抗體與腫瘤細胞特異性抗原結合，通過流式細胞儀對熒光信號的分析從而鑒別CTCs[20]。該方法的優點是不僅可以定量檢測CTCs，而且可以對CTCs多種參數(大小形態、細胞類型、存活狀態、細胞內外標記物)進行分析，更容易鑒別真正的陽性細胞，但檢測靈敏度較低，在外周血中尋找相對稀少的CTCs比較耗時。

陰性富集法也是檢測CTCs的常用策略。與陽性富集不同的是，免疫磁珠標記的抗體是能與大多數白細胞結合的抗CD45抗體，通過磁珠結合不需要的細胞而獲得分離出來的CTCs。類似的檢測方法還有Quadrupole magnetic separator[21]。

外周血中的單個核淋巴細胞和CTCs的密度與其他血液細胞的密度不同，在此物理特征基礎上建立了密度梯度離心技術，通過淋巴細胞分離液進行梯度離心富集單個核淋巴細胞和CTCs，從而達到富集CTCs的目的。在此技術基礎上與免疫學技術相結合建立了免疫梯度離心技術(RosetteSepTM)，利用單抗混合物使非靶細胞與全血中的多個紅細胞交聯，從而增加非靶細胞的密度，最后通過密度梯度離心去除非靶細胞，從而提高CTCs富集的效率。

2.2非標記檢測技術膜過濾法主要基于腫瘤細胞的尺寸一般較大的特點(平均直徑超過8um)[22]。ISET(isolation by size of epithelial tumor cells)技術，主要是利用腫瘤細胞直徑一般大于正常細胞的物理特性來分離CTCs[23]。將血液通過孔徑為8 μm的濾膜過濾，正常細胞濾過而CTCs聚集于濾膜上，從而達到富集作用。然而，外周血中單核細胞大小跨度較大，直徑可達17 μm左右[24]。因此，此方法不僅可能會漏掉直徑較小的CTCs，更可能捕獲較大的白細胞，從而使得其靈敏性及特異性下降[25]。此外，以細胞大小為基礎的檢測系統還有CellSieve[26-27]、Parylene filter[28-29]、SceenCell[30]。微流控與過濾通道相結合的檢測裝置也獲得了應用，通過對肺癌細胞系及肺癌臨床樣本的檢測證明這種基于CTCs大小的過濾微流體芯片相對于抗體依賴性檢測有更高的捕獲效率。目前，商業化的檢測設備有ClearCell FX、Vortex等。但由于CTCs大小和變形性等異質性，此類非標記捕獲技術很難有統一的檢測流程和質控標準。

2.3基于生物物理學特性的檢測技術相對于外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，CTCs在形態學及介電性能上有著本質的不同。介電性能與細胞的直徑，細胞膜面積、密度、導電率及體積等有關。ApoCell的ApoStream利用該特性在微流控通道上通過介電電泳場流分離的方法達到分離CTCs的目的，其特點是無需考慮EpCAM的表達，適用于后續的分析、培養等[31]。Silioon Biosystems的DEPArray同樣基于此生物物理學特性，可以分離單個CTC進行進一步的分析[32-34]。

2.4直接影像技術流式細胞術與免疫細胞化學技術結合檢測CTCs要求細胞流速較低，外周血中白細胞數量巨大，對于檢測相對較少的CTCs過于耗時而繁瑣。通過光纖陣列掃描技術(fiber optic array scanning technology，FAST)可以以快于普通電子顯微鏡500倍速度掃描，從而明顯提高檢測效率，但該方法操作復雜，價格昂貴，臨床應用受限[35]。

2.5其他檢測方法此外，還有基于CTCs功能性實驗達到鑒別的方法。如EPISOT技術通過抗CD45抗體陰性選擇除去白細胞后進行短期的細胞培養，通過對不同的標志物進行免疫熒光染色鑒別分泌的蛋白，從而達到鑒定CTCs的目的，其可能對CTCs形成腫瘤轉移復發機制的研究具有重要意義[36]。

近年來出現了一種稱為活體流式細胞儀的生物醫學光學儀器-PAFC技術[37]，將活體實時高速影像方法與體外流式細胞術結合起來，通過激光檢測一段時間內通過血管某處橫截面的帶有熒光標記的腫瘤細胞，可以檢測整個循環血的CTCs并進行計數，從而提高靈敏度，無需對患者抽血，可盡量避免抽血時CTCs從實體瘤間斷釋放帶來的影響。

Kojima等[38]報道了一種新型的檢測有活性CTCs的方法。該研究團隊構建了一種端粒酶特異性的選擇性復制的腺病毒(OBP-401)。該病毒載體用人端粒酶逆轉錄酶基因的啟動子(hTERT-p)調節腺病毒感染與復制，并在病毒的E3區插入由CMV啟動子調控的綠色熒光蛋白(GFP)基因。該病毒選擇性感染外周血中活的、高表達端粒酶的腫瘤細胞，并在腫瘤細胞中復制，使得綠色熒光蛋白隨著病毒的復制而高表達，讓我們通過普通的熒光顯微鏡就可以在大量的白細胞中比較容易地找到發出綠色熒光的腫瘤細胞。由于只有活細胞才能感染病毒并支持病毒復制，故通過該方法發現的腫瘤細胞應該是能在外周血中較長時間生存的活細胞，這種活CTCs的檢出對于判斷預后、評價療效等臨床關心的問題應該更具有參考價值。Kim等[39]通過采用這種新型方法檢測早期及晚期乳腺癌患者的CTCs，同時與CellSearch檢測結果進行對比，發現二者在陽性率方面差別不大。

3展望

CTCs檢測方法近年來發展很快，但是仍有很多問題亟待解決。建立一系列規范的檢測流程和評價標準，提高特異性及靈敏性，能夠進行后續CTCs分析仍是臨床應用的關鍵。目前，世界上大多數研究集中于CTCs的計數以及其臨床指導價值。但這些也許僅僅是“冰山一角”，CTCs檢測不僅可以作為一種“液體活檢”，更可以在目前研究的基礎上進行單個CTC的分子生物學特征分析，發現特異的靶點，用于指導個體化靶向治療、幫助理解腫瘤細胞異質性等，這些均將成為腫瘤的基礎研究及臨床應用的有益探索。

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(收稿日期：2015-10-26)

【中圖分類號】R 73-3

doi:10.3969/j.issn.1004-437X.2016.03.036

通訊作者：劉紅，E-mail: liuhong925@126.com。