流式細胞術在冠心病患者診療中的作用研究進展

顧　進 綜述，顧蕓蕓，仲崇明 審校

(連云港市中醫院檢驗科，江蘇連云港 222004)

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流式細胞術在冠心病患者診療中的作用研究進展

顧進 綜述，顧蕓蕓，仲崇明 審校

(連云港市中醫院檢驗科，江蘇連云港 222004)

關鍵詞:流式細胞術；冠心病；診療

冠心病是危害人類健康與生命的心血管疾病，其基本病理變化是冠狀動脈血管發生動脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死。世界衛生組織將冠心病分為5大類：無癥狀心肌缺血(隱匿性冠心病)、心絞痛、心肌梗死、缺血性心力衰竭(缺血性心臟病)和猝死5種。臨床上又常分為穩定性冠心病和急性冠狀動脈綜合征。流式細胞術(FCM)是一種通過熒光染料標記對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段。它綜合了光學、電子學、流體力學、免疫學、細胞化學、計算機等多門學科為一體，是當代最先進的細胞分析技術。其特點是測量速度快，可進行多參數測量且既是細胞分析技術，又是精確的分選技術。由于冠心病的動脈粥樣硬化的斑塊是處于動態變化的過程，所以醫學影像學的靜態局部檢測往往具有局限性，這使得非入侵性的血液學檢測其相關標記物來預測動脈粥樣硬化斑塊的動態成為一種能夠彌補影響學局限性的重要方法。而且近年來，隨著FCM的發展和普及，血液學檢測相關標記物變得越來越簡單易行。本文對近些年使用FCM在冠心病患者中的使用進行綜述。

1淋巴細胞分析與冠心病的關系

炎癥和免疫反應在動脈粥樣硬化的發生、發展中起著重要的作用，因此與冠心病有著密切的聯系。冠心病的炎癥可能不僅僅局限于血管壁，而且包括全身免疫系統的反應[1]。T 淋巴細胞亞群是公認的機體免疫反應的敏感指標，所以T 淋巴細胞亞群與冠心病的關系也非常密切。湯涌等[2]采用FCM測定 T淋巴細胞亞群(CD4、CD8、CD4/CD8)發現，T細胞亞群中CD4細胞數量在早發冠心病中明顯異常,CD4/CD8異常代表的免疫功能紊亂在早發冠心病中起著重要的作用。聶大奧等[3]研究的結果也顯示冠心病患者 CD3+細胞占淋巴細胞比例明顯高于正常非冠心病患者人群；不穩定型心絞痛組以及急性心肌梗死組CD4+及CD8+細胞占CD3+細胞比例明顯異常于穩定型心絞痛患者；通過外周血T細胞與 Gensini 評分表明機體免疫功能紊亂可能參與急性心肌梗死的發生，間接或直接引起梗死面積擴大或并發癥的發生。另外研究發現[4-5]，CD4+CD28-T細胞在穩定性斑塊中不存在，僅存在于不穩定性斑塊，提示 CD4+CD28-T細胞與斑塊破裂有直接的關系，其原因可能是由于動脈粥樣斑塊中的大部分 T 細胞包括CD4+CD28-T細胞分泌γ-IFN，促進巨噬細胞分化為泡沫細胞及其他抗原提呈細胞可引起斑塊破裂。有學者認為[6-7]，CD4+CD25+Treg 是一個具有獨特免疫調節功能的 T 細胞亞群，人體主要通過CD4+CD25+Treg 以免疫負向調節的方式來抑制自身反應性 T 細胞的作用，減少免疫性疾病的發生，從而維持機體內環境的穩定，維持免疫耐受，而在冠心病中其比例降低導致機體免疫功能紊亂，從而參與冠心病的發生、發展。

T細胞表面CD31是血管內皮細胞(EPC)集落形成和構成中央集群必不可少的分子，而EPC是冠狀動脈疾病(CAD)的一個重要標志，若EPC減少會造成心血管疾病的風險增加[8]，因此，EPC被認為是預測冠狀疾病的生物學標記。盡管CD31分子在CAD中的臨床意義仍不清楚，但是Flego等[9]發現在急性冠脈綜合征患者體內，若T細胞表面CD31分子的抑制活性喪失后，體內會出現一種免疫球蛋白樣的黏附分子，從而導致實驗模型產生動脈粥樣硬化樣的改變，因此Flego等[9]通過流式檢測急性冠脈綜合征患者體內T細胞表面CD31的表達以及其在TCR信號傳導中的作用，發現在患者體內總的CD4+T細胞和CD4+CD28null T細胞表面的CD31表達均降低，且相比穩定性心絞痛患者，急性冠脈綜合征患者體內CD31對TCR信號傳導的免疫調節效果更差。該結果提示CD31可以作為一個新穎的靶分子來治療急性冠脈綜合征患者T細胞異常。因此，Kakizaki等[10]針對這種問題提出增加急性冠脈綜合征患者體內的CD3+/CD31+T細胞。

T淋巴細胞上有3個絲裂原激活的蛋白激酶/MAP激酶(MAPK)信號通路，他們是ERK1/2，JNK 和p38。研究者通過評估這個通路的活性[11]，采用FCM檢測磷酸化后的ERK1/2，JNK 和p38，他們發現穩定性心絞痛患者磷酸化的JNK與對照組相比，沒有明顯的改變；而ERK1/2明顯增高。非ST段抬高型心絞痛和ST段抬高型心絞痛的患者磷酸化的ERK1/2、JNK均明顯增高。除了穩定型冠狀動脈疾病(CAD)患者，所有的急性冠脈綜合征患者(ACS)的p38都增高了。這些結果可以作為診斷不穩定性心絞痛的特異性生物學標記。

有學者在患有冠狀動脈疾病患者的外周血中可以檢測到OxLDL和HSP-60抗原特異性CD8+T淋巴細胞[12]，OxLDL和HSP-60抗原通過刺激斑塊內的淋巴細胞從而成為冠心病的發病原。作者用p/MHC五聚體復合物染色經過FCM檢測，結果在健康人體內OxLDL和HSP-60抗原特異性T細胞不能被檢測到，而在穩定型和不穩定型心絞痛患者的外周血中這兩種抗原的特異性T細胞能夠被檢測到。這個發現使得人們認識到OxLDL和HSP-60抗原特異性CD8+T細胞在動脈粥樣硬化冠狀動脈疾病中也起到一定的作用。

2單核細胞分析與冠心病的關系

研究發現冠心病患者CD14++CD16+單核細胞以及總的CD16+的單核細胞水平顯著增高，且總的CD16+的單核細胞水平與冠狀動脈粥樣硬化斑塊的不穩定性有關[13]。Tallone等[14]發現冠心病患者體內CD14+CD16++單核細胞增高了90%，且鑒于Tallone等[14]的研究結果，楊國紅等[15]建立基于四色的FCM檢測外周血單核細胞亞群及各亞群單核細胞-血小板聚集體(MPA)的方法，并觀察冠心病患者外周血單核細胞亞群及各亞群MPA的變化特點。他們采集冠心病患者的外周靜脈血依據單核細胞和血小板的標志性分子CD86、CD14、CD16和CD41對單核細胞亞群和MPA進行四色的流FCM分析并利用Flow-countTM熒光微球對單核細胞亞群及各亞群所形成的MPA進行絕對計數，該方法重復性好，結果可靠。結果發現冠心病組患者外周血CD14++CD16+和CD14+CD16++所占百分比和絕對計數均顯著高于對照組，冠心病患者總MPA以及CD14++CD16+相關的MPA所占百分比和絕對計數也顯著增高，結果提示中間型單核細胞及其形成的MPA可能是臨床上冠心病患者的一個潛在的診斷和治療靶點。

秦光明等[16]利用FCM對冠心病患者進行單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)的測定，結果發現MCP-1有上升，但是靈敏度不高，尚不如IL-6等細胞因子，還不能作為冠心病嚴重程度的估計和預測。但張錄站等[17]研究認為早發冠心病患者MCP-1水平明顯增高，是斑塊不穩定的標志之一。而王鋒劍等[18]研究認為急性冠狀動脈綜合征患者TLR4和MCP-1水平呈正相關，推測MCP-1可能與動脈硬化相關。目前關于MCP-1與冠心病的研究較少，結論也不太一致，需要更多的研究來明確其在冠心病中的應用價值。

另外，由于 Toll樣受體分布廣泛，主要表達于單核細胞表面，屬模式識別受體，TLRs最突出的生物學功能是促進細胞因子的合成與釋放，引發炎性反應。研究認為 TLR4與心血管疾病關系最為密切[19]。通過對人及小鼠模型的動脈粥樣硬化組織切片進行免疫組化分析，發現TLR4在粥樣斑塊組織表達，尤其在巨噬細胞浸潤、脂質豐富的部位明顯表達。當損傷和硬化的動脈處存在有內源性配體如低度修飾的低密度脂蛋白(mmLDL)時，TLRs通路即被活化，啟動胞內信號轉導，最終激活核因子κB(NF-κB)，參與動脈粥樣硬化的發生、發展。免疫炎性反應不僅是動脈粥樣硬化的觸發因素，而且是造成斑塊不穩定的重要因素之一。趙順鋒[20]采用FCM檢測外周血單核細胞 TLR4表達，結果發現冠心病患者TLR4表達上調，提示 TLR4及其介導的炎性反應與冠心病的發生、發展有關。

清道夫受體參與血管炎疾病的發生和發展過程已經被證實，但其機制尚不明確。Piechota等[21]研究清道夫受體CD36和MSR1在冠心病患者出現癥狀后以及治療第六個月后的表達情況，通過FCM和定量PCR檢測發現所有有癥狀的急性冠脈綜合征患者體內單核細胞上的CD36和MSR1 mRNA的數量及其密度都顯著增高。經過6個月的阿托伐他汀治療后，CD36和MSR1 的表達水平有了明顯的下降。該研究表明清道夫受體也參與了ACS的發生、發展。

3血小板功能分析與冠心病的關系

在冠狀動脈粥樣硬化、斑塊破裂乃至血栓生成過程中，血小板活化和血小板聚集起了舉足輕重的作用[22]。其原因是在正常血液循環中，大量血小板幾乎均處在休眠狀態，當受生理或病理刺激時，血小板發生活化，在相當一部分血小板膜上表達出一種或多種活化血小板分子標志代表物。

血小板CD62P(P選擇素)是一種細胞黏附分子，存在于內皮細胞的Weibel-Palade小體和血小板的α顆粒中，是血小板活化的一個特征性指標，在炎性反應和血栓形成中起著中心調控作用，當血小板被活化時，CD62P迅速從胞內翻轉至細胞表面，表達明顯升高[23]，所以是血小板活化的重要標志。CD41是血小板質膜表面變化的GPⅡb/Ⅲa糖蛋白表位，在血小板活化時才因構象變化而暴露出來，是血小板活化早期的標志物。由于在生理和病理情況下，血小板群和紅細胞群的大小、顆粒度會有交叉。因此，采用CD41/CD62雙染色計算血小板CD62表達陽性率，能準確地區分血小板群，從而更敏感而精確地檢測血小板的活化狀況[24]。任澎等[25]選擇40例冠狀動脈綜合征患者采用FCM測定其應用阿司匹林及氯吡格雷抗血小板治療前后血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa和P選擇素(CD62P)水平的變化，并與正常組進行比較。檢測結果表示發現ACS患者聯合抗血小板治療前后血小板GPⅡb/Ⅲa和CD62P 的表達均明顯高于對照組，表明AMI 患者有明顯的血小板活化，提示ACS患者體內血小板的黏附、聚集、釋放反應均增高。同時血小板GPⅡb/Ⅲa和CD62P 的表達是很好的血小板聚集功能的檢測指標，在藥物治療的過程中需要連續監測。

龔曉璇等[26]首次在國內建立了用FCM測定血小板COX-1、COX-2表達的方法，采用FCM檢測時，因PE-CD42b抗體能特異性識別血小板膜糖蛋白，故在FITC-COX-1、FITC-COX-2抗體與COX-1、COX-2結合的基礎上，再用PE-CD42b標記識別血小板，避免了源于血樣中的其他成份如白細胞等外源性COX-1、COX-2的干擾。因此，使用FCM檢測血小板COX-1、COX-2較Western blot等方法具有更高的特異性，可以提升在冠心病中的診斷價值。

4細胞因子檢測與冠心病的關系

血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)為細胞表面單鏈糖蛋白，分布于內皮細胞、白細胞、單核細胞、成纖維細胞、巨噬細胞表面，sVCAM-1是VCAM-1的可溶性形式。VCAM-1主要是介導細胞間、細胞與細胞外基質黏附，參與多細胞生物體各種生理、病理過程。在冠狀動脈粥樣硬化炎癥過程發生發展的各個階段都扮演著重要的角色[27]。血管內皮細胞生長因子(VEGF)是迄今發現的具有特異性促進血管內皮細胞有絲分裂的生長因子，在促進血管生成、再生和抗動脈硬化及治療中發揮著重要的作用。

馬愛玲等[28]研究急性冠狀動脈綜合征患者與穩定性冠心病患者和健康人比較，急性冠狀動脈綜合征患者的VCAM-1和VEGF水平顯著高于穩定性冠心病患者和健康人。胡萍[29]研究認為冠心病患者血清中VCAM-1和VEGF的水平顯著高于健康人群，同時3支病變患者VCAM-1和VEGF水平高于單支和雙支病變組，因此黏附分子水平可以判斷冠脈病變數目和病變程度。鄭金鼎等[30]研究認為VCAM-1和VEGF在冠心病的發生發展中起一定的作用，對冠心病的診斷和分層有一定的臨床價值，同時用流式細胞技術是可以準確方便地進行定量檢測。因此，利用FCM檢測VCAM-1和VEGF對冠心病患者的臨床診療有著非常好的作用和價值。

5展望

冠心病實際是炎癥介導和免疫反應的過程，斑塊內激活的內皮細胞、單核巨噬細胞、T淋巴細胞及平滑肌細胞都能通過旁分泌和自分泌作用產生各種活性物質如細胞因子、黏附分子、蛋白水解酶等一系列炎癥免疫反應物質，促進平滑肌減少和細胞外基質降解，導致斑塊不穩定破裂和血栓形成。因為這是一個動態的過程，所以用影像學靜態局部檢測往往具有很大的局限性。而可以通過FCM檢測不同時間段的相關生物學標記物，能夠盡早的預測觀測動脈粥樣斑塊的變化程度，為防止斑塊破裂提供預防和診斷的線索。同時通過FCM檢測冠心病患者體內的生物學標志物，臨床上可以用來評估藥物的療效。因此，目前FCM在冠心病檢測方面已經得到了廣泛的應用，其準確性不但可以評估冠心病的輕重程度，還可以成為藥物治療療效的指標之一。

FCM發展迅速，具有自身特點及其應用優勢，目前多方面應用于冠心病的研究，在該病的病情評估，指導臨床治療、療效觀察及探索發病機制等方面有一定的作用及地位。隨著FCM技術的不斷發展，未來在冠心病的研究中將會發揮更重要的作用，為該病的檢測和綜合防治提供新的方向。

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(收稿日期：2016-01-18)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.09.036

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)09-1241-03

作者簡介：顧進，女，主任技師，主要從事醫學免疫學研究。