綿馬貫眾石油醚提取物化學成分研究

袁麗鵬，鄧國彤，賈小舟，劉海燕，楊雄輝，沈志濱

(1.廣東藥學院 中藥學院，廣東 廣州 510006； 2.國藥集團德眾(佛山)藥業有限公司，廣東 佛山 528000)

?

綿馬貫眾石油醚提取物化學成分研究

袁麗鵬1，鄧國彤1，賈小舟1，劉海燕1，楊雄輝2，沈志濱1

(1.廣東藥學院 中藥學院，廣東 廣州 510006； 2.國藥集團德眾(佛山)藥業有限公司，廣東 佛山 528000)

摘要:目的 研究綿馬貫眾Dryopteris crassirhizoma Nakai石油醚部位的化學成分。方法 采用硅膠柱色譜、凝膠Sephadex LH-20柱色譜和半自動制備液相色譜等手段進行分離純化，通過理化性質及光譜分析方法鑒定化合物的結構。結果 從綿馬貫眾石油醚提取物中分離得到5個化合物，經鑒定分別為膽甾-4-烯-3-醇(1)、海綿甾醇(2)、木栓內酯(3)、β-谷甾醇(4)、西瑞香素(5)。結論 化合物1、2、3、5為首次從該植物中分離得到。

關鍵詞:綿馬貫眾； 化學成分； 結構鑒定； 甾體

綿馬貫眾DryopteriscrassirhizomaNakai為鱗毛蕨科植物粗莖鱗毛蕨的干燥根莖及葉柄殘基，別名貫眾、東北貫眾等，始載于《神農本草經》，味苦、微寒，有小毒，具有治療風熱頭痛、溫毒發斑、瘡瘍腫毒的功效，作為常用中藥被收錄在2010年版《中國藥典》[1]，主產于黑龍江、遼寧、吉林和河北北部地區[2]。現代臨床中常見綿馬貫眾單用或復方治療癌癥、流感病毒、真菌原蟲感染等疾病。迄今為止，已從綿馬貫眾中分離或鑒定出間苯三酚類、黃酮類、萜類、甾類、苯丙素類、苷類、脂肪烴類、芳香烴類、糖類等多種類型化合物，其中多聚間苯三酚類衍生物為綿馬貫眾的主要活性成分，主要分為二環、三環、四環、五環四大類；黃酮類化合物的報道較少；萜類化合物大多數為五環三萜類苷元[3]。本實驗室前期已對綿馬貫眾乙酸乙酯提取部位化學成分進行了分離，本文對綿馬貫眾的石油醚提取部位進行分離，得到5個化合物，經鑒定分別為膽甾-4-烯-3-醇(1)、海綿甾醇(2)、木栓內酯(3)、β-谷甾醇(4)、西瑞香素(5)，其中化合物1、2、3、5均為首次從該植物中分離得到。

1儀器與試藥

Acquity UPLC H-Class超高效液相色譜儀(美國Waters公司)；XBridgeTMBEH C18柱 (100 mm×4.6 mm，2.5 μm)分析色譜柱(美國Waters公司)；LC-6AD型半制備液相色譜儀(日本島津公司)；ZORBAX StableBond C18柱(250 mm×9.4 mm，5 μm) 制備色譜柱(美國Agilent公司)；Hei-VAP旋轉蒸發儀(德國Heidolph公司)；DLSB型低溫冷卻循環泵(鄭州長城科工貿有限公司)；AGX1-2001-P型艾科浦(Aquapro)超純水系統(重慶頤洋企業發展有限公司)。

AVANCE AV500型核磁共振儀(瑞士Bruker公司)；Zf20D暗箱式紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠)；YOKO-XR顯色加熱器(武漢藥科新技術開發公司)；X-5顯微熔點測定儀(鞏義市科瑞儀器有限公司)。

綿馬貫眾采自黑龍江北部地區，購于河北金木藥業集團有限公司，經廣東藥學院中藥學院劉基柱副教授鑒定為鱗毛蕨粗莖鱗毛蕨(DryopteriscrassirhizomaNakai)的葉柄殘基和干燥根莖。

硅膠(青島海洋化工廠，批號：130560)；Sephadex LH-20凝膠(Pharamacia公司，批號：051219)；乙腈、甲醇(色譜純，瑞典Oceanpak)；石油醚、丙酮、甲醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、乙酸等均為分析純。

2提取與分離

取綿馬貫眾粗粉30 kg，加入10倍量的石油醚浸泡1 h后，70 ℃回流提取3次，每次3 h，回收石油醚得到浸膏(2.1 kg)。取浸膏(2.1 kg)上硅膠(200～300目)柱色譜以石油醚-丙酮梯度洗脫(體積比100∶0→100∶1→50∶1→25∶1→10∶1)，TLC檢測合并相同的流分，得到5個主要部位Fr.1～Fr.5。Fr.3(石油醚-丙酮，體積比50∶1)部分，經過多次硅膠柱色譜分離得到化合物1(20 mg)。Fr.4(石油醚-丙酮，體積比25∶1)部分，經過反復的硅膠柱色譜和Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離，配合甲醇重結晶得到化合物2(18 mg)。Fr.5(石油醚-丙酮，體積比10∶1)部分，經過多次硅膠柱色譜和Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離，TLC檢測合并相同組分再借助半自動制備液相色譜(乙腈-蒸餾水，體積比85∶15；流速8 mL/min)制備，分離得到化合物3(12 mg)、4(8 mg)、5(10 mg)。

3結構鑒定

化合物1：白色粉末(三氯甲烷)，mp：148～150 ℃，易溶于三氯甲烷，不溶于甲醇、水和丙酮。三氯甲烷-乙酸乙酯(體積比10∶1)條件下TLC檢識，碘蒸氣顯色，Rf值0.4處有斑點，但254 nm紫外照射下無此斑點，提示此化合物無長共軛結構。樣品溶于三氯甲烷，加入濃H2SO4后，H2SO4層顯血紅色，三氯甲烷呈現綠色熒光，顯示Salkowski反應呈陽性。另外樣品溶于三氯甲烷，加入醋酐-濃H2SO4(體積比20∶1)，產生紅→紫→藍→綠等一連串的顏色變化，最后褪色，顯示Liebermann-Burchard反應呈陽性，推測此化合物為甾體類化合物。樣品中加入濃H2SO4,再加入α-萘酚，無紫色環出現，Molish反應呈陰性，表明此化合物可能為苷元型化合物。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：1.01(3H，s，19-CH3),0.68(3H，s，18-CH3),0.93(3H，d，J=7.5 Hz，27-H),0.82(3H，d，J=5 Hz，26-H),3.53(1H，m，3-CH),5.36(1H，brs，4-H)。13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：141.1(C-5),121.9(C-4),72.1(C-3),57.1(C-14),56.5(C-17),50.5(C-9),46.3(C-13),42.7(C-4),40.1(C-12),37.6(C-1),36.8(C-10),32.3(C-8),32.2(C-7),32.0(C-2),28.5(C-16),24.6(C-15),21.4(C-11),36.4(C-20),34.3(C-22),29.6(C-25),23.6(C-23),19.6(C-21),19.4(C-26),19.1(C-27),20.0(C-19),12.3(C-18)。以上數據與文獻[4-5]報道基本一致，故鑒定化合物1為膽甾-4烯-3醇(Cholesta-4-en-3-ol)。

化合物2：白色針狀晶體(三氯甲烷)，mp：148～150 ℃，易溶于三氯甲烷，不溶于甲醇、水和丙酮。三氯甲烷-丙酮(體積比15∶1)條件下TLC檢識，碘蒸氣顯色，Rf值0.4處有斑點，但254 nm紫外照射下無此斑點。樣品Liebermann-Burchard反應呈陽性，Salkowski反應呈陽性，Molish反應呈陰性。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：0.68(3H，s，18-CH3),1.01(3H，s，19-CH3),0.92(3H，d，J=6.5 Hz，27-CH3),0.84(3H，d，J=6.5 Hz，26-CH3),3.52(1H，m，3-CH),5.35(1H，brs，6-H)。13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：140.8(C-5),121.7(C-6),121.6(C-24),116.4(C-28),71.8(C-3),56.8(C-14),56.1(C-17),50.1(C-9),45.8(C-13),42.3(C-4),39.8(C-12),37.3(C-1),36.5(C-10),34.0(C-8),31.7(C-7),31.9(C-2),28.3(C-16),24.3(C-15),21.1(C-11),36.1(C-20),23.1(C-22),29.2(C-25),33.9(C-23),19.4(C-21),19.1(C-26),18.8(C-27),19.8(C-19),12.0(C-18)。以上數據與文獻[6-7]報道基本一致，故鑒定化合物2為海綿甾醇(Chalinasterol)，又名5,24(28)-二烯麥角甾-3-醇[ergosta-5,24(28)-dien-3-ol]。

化合物3：無色針晶(三氯甲烷)，mp：286～288 ℃，易溶于三氯甲烷，不溶于甲醇、水和丙酮。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：0.80(3H，s，25-CH3),0.82(3H，s，26-CH3),0.84(3H，s，24-CH3),0.84(3H，s，27-CH3),1.21(3H，s，28-CH3),1.38(3H，d，J=6.3 Hz，23-CH3),4.11(1H，q，J=6.6 Hz，4-CH)。13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：175.4(C-3),87.0(C-4),56.8(C-10),51.8(C-8),51.8(C-18),42.2(C-5),37.5(C-13),36.2(C-9),36.9(C-14),36.6(C-17),37.3(C-6),36.8(C-19),32.4(C-2),32.4(C-11),32.1(C-22),32.0(C-15),31.8(C-12),29.8(C-16),29.8(C-21),29.6(C-20),18.2(C-1),18.0(C-7),36.8(C-29),32.1(C-30),31.9(C-28),22.2(C-26),19.9(C-27),19.3(C-25),14.3(C-23),14.2(C-24)。以上數據與文獻[8-10]報道基本一致，故鑒定化合物3為木栓內酯(Friedelan-3,4-lactona)。

化合物4：無色針晶(石油醚-乙酸乙酯)，mp：137～138 ℃，三氯甲烷-甲醇(體積比30∶1)條件下TLC檢識，H2SO4乙醇溶液顯色，Rf值0.4處有紫紅色斑點。樣品Liebermann-Burchard反應呈陽性，提示存在甾體母核。與β-谷甾醇對照品對照，多個展開系統下TLC檢識，二者色譜行為和顯色表現一致，混合熔點不下降，與文獻[11]報道基本一致，故確定化合物4為β-谷甾醇(β-sitosterol)。

化合物5：淡黃色無定形粉末(乙酸乙酯)，mp：250～252 ℃，三氯甲烷-乙酸乙酯(體積比15∶1)條件TLC檢識，碘蒸氣顯色，Rf值0.4處有斑點，在365 nm紫外照射下斑點呈亮藍色，FeCl3試管中反應呈陽性。1H-NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：10.29(1H，s)；8.05(1H，d，J=9.5 Hz，H-4′),6.38(1H，d，J=9.5 Hz，H-3′),7.87(1H，s，H-4),7.71(1H，d，J=8.5 Hz，5′-CH3),7.18(1H，d，J=2.5 Hz，6′-CH2),7.12(1H，dd，J=8.5，2.5 Hz，8′-CH3),7.20(1H，s，5-H),6.86(1H，s，8-H),3.81(3H，s，—OCH3)。13C-NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：160.0(C-2),159.6(C-2′),157.0(C-7),155.0(C-7′),150.3(C-9),147.4(C-9′),145.6(C-6),144.0(C-4′),135.7(C-3),130.9(C-5′),129.9(C-4),114.4(C-10′),113.9(C-6′),113.4(C-3′),110.2(C-10),109.4(C-5),104.0(C-8′),102.7(C-8),56.0(OCH3)。以上數據與文獻[12]報道基本一致，故鑒定化合物5為西瑞香素(Daphnoretin)。

參考文獻:

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部[M].北京:中國醫藥科技出版社,2010:310.

[2] 高增平,馬秉智,陸蘊如.綿馬貫眾的化學成分研究[J].北京中醫藥大學學報,2004,27(1):52-53.

[3] 張鵬,宋盼紅,付深圳,等.綿馬貫眾化學成分和藥理作用的研究進展[C]//中華中醫藥學會中藥化學分會第九屆學術年會論文集：第一冊.中華中醫藥學會,2014:20.

[4] 傅宏征,張曉威,張禮和,等.黃海葵的化學成分研究(Ⅰ)[J].中國海洋藥物,1998，17(1):13-16.

[5] 李莉婭,鄧志威,李軍,等.中國南海海綿Cinachyrellaaustraliensis化學成分研究[J]. 北京大學學報(醫學版),2004,36(1):12-17.

[6] VIEGELMANN C,JENNIFER P,THENGTHENG O,et al. Isolation and identification of antitrypanosomal and antimycobacterial active steroids from the spongeHaliclonasimulans[J].Marine Drugs,2014,12(5):2937-2952.

[7] 杜德堯,陳永強,陳先暉,等.木蹄層孔菌石油醚組分的成分分析及抗腫瘤活性研究[J].藥物分析雜志,2011,31(2):261-264.

[8] DE CARVALHO JUNIOR A R,GOMES G A,FERREIRA R O,et al. Constituintes químicos e atividade antioxidante de folhas e galhos deEugeniacopacabanensisKiaersk (Myrtaceae)[J].Quim Nova,2014,37(3):477-482.

[9] 孫偉.苦味葉下珠的化學成分研究[J].中草藥,2011,43(1):23-26.

[10] 王輝,熊志勇,陳澤宇,等.滇南紅厚殼葉中木栓內酯的分離、結構鑒定及誘導干細胞增殖作用[J].云南大學學報(自然科學版),2010,32(6):690-694.

[11] 徐丹丹,周洪波,房志堅.粗葉懸鉤子的化學成分研究[J].廣東藥學院學報,2012,28(2):142-144.

[12] 路利芹,崔海燕,張立春,等.瑞香狼毒地上部分化學成分的研究[J].天然產物研究與開發,2014,26(1):53-55.

(責任編輯：陳翔)

Study on the chemical constituents of petroleum ether extract fraction fromDryopteriscrassirhizomaNakai

YUAN Lipeng1,DENG Guotong1,JIA Xiaozhou1,LIU Haiyan1,YANG Xionghui2,SHEN Zhibin1

(1.SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.SinopharmGroupDezhongPharmaceuticalLimitedCompany,Foshan528000,China)

Abstract:Objective To study the chemical constituents of petroleum ether extract fraction from Dryopteris crassirhizoma Nakai. Methods The chemical constituents of petroleum ether extract fraction were isolated by silica gel column chromatography,Sephadex LH-20 column chromatography and semi-preparative chromatography. The structures of the compounds were identified on the basis of physiochemical properties and spectral analyses. Results Five compounds were isolated and identified as Cholesta-4-en-3-ol (1),Chalinasterol (2),Friedelan-3,4-lactona (3),β-sitosterol (4),Daphnoretin (5) respectively. Conclusion Compounds 1～3 and 5 were isolated from Dryopteris crassirhizoma Nakai for the first time.

Key words:Dryopteris crassirhizoma Nakai; chemical constituents; structural identification; steroids

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2015102501

中圖分類號：R284.2

文獻標志碼：A

文章編號:1006-8783(2016)01-0019-03

作者簡介：袁麗鵬(1990—)，男，2013級碩士研究生，Email：1315935853@qq.com；通信作者：沈志濱(1964—)，女，博士，教授，碩士生導師，主要從事中藥藥效物質基礎和復方制劑質量控制的研究，Email：szb8113@126.com。

基金項目：廣東省自然科學基金項目(2015A030313585)；國家中醫藥管理局行業專項(201507004)

收稿日期：2015-10-25

網絡出版時間：2016-01-15 16:50網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160115.1650.004.html