靶向肝星狀細胞的基因治療逆轉肝纖維化的研究進展

諶雙君 趙衛華 叢敏

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靶向肝星狀細胞的基因治療逆轉肝纖維化的研究進展

諶雙君 趙衛華 叢敏

作者單位：100050 首都醫科大學附屬北京友誼醫院肝病中心，肝硬化轉化醫學北京市重點實驗室，國家消化系統疾病臨床醫學研究中心

肝纖維化由肝臟受到慢性損傷后細胞外基質的過度沉積引起，激活的肝星狀細胞（HSCs）是細胞外基質的主要來源。肝纖維化是許多慢性肝臟疾病的共同病理基礎與特征，包括病毒性和自身免疫性肝炎，鐵沉積，酒精性肝病和膽汁淤積等。目前認為肝臟細胞外基質的合成與降解失衡，導致其在肝內過度沉積是肝纖維化發展的主要機制。肝損傷導致HSCs活化并失去其靜止表型?；罨腍SCs具有肌成纖維細胞樣表型，細胞骨架蛋白表達上調如a-SMA，同時分泌大量膠原。HSCs是肝臟中主要的促纖維化細胞，是細胞外基質的主要來源［1，2］。肝纖維化如果不能得到及時治療將會進展為肝硬化甚至肝細胞癌，并會出現一系列并發癥如食管靜脈曲張破裂出血、肝性腦病、腹水、肝腎綜合征等，給患者帶來巨大的痛苦甚至威脅生命［2］。為此，針對肝纖維化逆轉，尤其是抑制HSCs活化或者誘導活化后HSCs凋亡的研究成為近年來研究的熱點。由于，目前對肝纖維化逆轉的研究主要是通過作用于HSCs，抑制其促纖維化基因的表達及誘導其凋亡等?，F就近年來靶向肝星狀細胞的基因治療研究進展綜述如下。

一、靶向阻斷HSCs受體-配體的相互作用促進肝纖維化的逆轉

（一）轉化生長因子β1（TGFβ1）及其受體 肝纖維化過程中，HSCs被激活并且通過提高對可溶性介質的反應能力進行增殖，進而發揮促炎及促纖維化作用［3］。在這些可溶性介質中，TGFβ1是一個很重要的細胞因子，其通過Smad2/3信號通路促進HSCs的激活［3］。在纖維化動物模型及肝纖維化病人體內均可檢測到TGFβ信號通路的增強［4］，因此，阻斷TGFβ介導的這一信號通路對有效逆轉肝纖維化具有重要意義。

有研究［3］發現通過微小RNA（miRNA）-101抑制TGFβ信號通路進而能夠緩解肝纖維化。研究者通過建立四氯化碳（CCl4）誘導的小鼠肝纖維化模型發現在肝纖維化進展過程中，肝組織、激活的星狀細胞及受損的肝細胞miR-101表達水平顯著降低；通過預防性給予以慢病毒為載體的miR-101可以顯著減輕肝纖維化，而給予反義寡核苷酸抑制miR-101的表達后加重肝纖維化。此外，體外實驗發現miR-101抑制活化星狀細胞的增殖和遷移及活化標志物的表達，使星狀細胞由活化狀態轉化為靜止狀態。究其機制，miR-101在肝纖維化形成過程中通過靶向作用于TGFβ1受體（TβRI）及其轉錄激活因子KLF6，進而抑制TGFβ信號通路，最終抑制促纖維化細胞因子的產生、肝細胞凋亡，促進肝纖維化的逆轉。

此外，另有研究發現miR-30也在肝纖維化中參與TGFβ信號通路的調控。以腺病毒為載體誘導miR-30在CCl4肝纖維化小鼠模型中的表達，可以通過miR-30作用于轉錄因子KLF11進而抑制TGFβ信號通路［5］，最終顯著降低肝纖維化程度。

因為系統性抑制TGFβ會誘發機體炎癥反應或者導致上皮細胞增生甚至腫瘤的發生，因此靶向HSCs中的TGFβ信號通路可能是肝纖維化治療中的一個潛在治療靶點。

（二）神經受體 內源性大麻素（CB）家族起源于花生四烯酸，其通過與CB1和CB2受體結合，抑制免疫細胞的活化，維持輔助性T細胞（Th）1/Th2的平衡，進而發揮免疫調節作用［6］。近年來研究發現肝硬化病人肝內肌成纖維細胞CB1受體表達增加，并且小鼠肝纖維化模型及非酒精性脂肪性肝炎模型中肝臟肌成纖維細胞表達的CB1受體增高［7］。

有學者［8］通過構建以慢病毒為載體靶向作用于CB1受體的小干擾RNA（CB1-RNAi-LV）發現其在抑制大鼠原代HSCs 的CB1受體表達的同時可以顯著抑制星狀細胞的活化、增殖及細胞外基質的產生。此外，給予大鼠尾靜脈注射CB1-RNAi-LV治療，可以明顯降低二甲基亞硝胺誘發的肝纖維化程度，大鼠肝臟間充質細胞標志物α-SMA，波形蛋白等表達水平均降低。此研究通過體外、體內實驗證實了抑制星狀細胞CB1受體的表達對肝纖維化具有抑制作用。

另有研究［9］發現外周選擇性CB1受體拮抗劑VD60能顯著抑制大鼠原代HSCs及人星狀細胞系LX-2的增殖，使α2（I）前膠原MRNA表達水平顯著降低。此外，VD60在CCl4誘導的小鼠肝纖維化模型體內具有抗纖維化活性。綜上所述，抑制HSCs CB1受體已為肝纖維化的治療提出新的思路。

（三）血管緊張素II1型（AT1）受體 血管緊張素II由星狀細胞分泌，其可與1型受體結合，通過JAK2介導的信號通路發揮作用［10］。應用血管緊張素轉化酶（ACE）抑制劑或AT1受體阻滯劑（ARBs）阻斷腎素-血管緊張素系統對臨床肝纖維化的治療可能有效。有研究［11］發現AT1與大麻素通過受體的異二聚體作用可以發揮協同作用。研究者通過運用免疫共沉淀、共振能量轉移分析等方法發現AT1受體與CB（1）受體形成異二聚體，從酒精性飲食的大鼠肝臟內分離HSCs，發現其AT1 R-CB（1）R異聚體表達水平顯著升高，血管緊張素II介導的信號通路表達增強。此外，阻斷CB1受體的活性可以抑制血管緊張素II介導的促有絲分裂信號通路，使促纖維化基因表達降低。這為聯合應用ARB和CB1受體阻斷劑治療肝纖維化提供了理論依據。

（四）酪氨酸蛋白激酶受體 許多增殖性細胞因子包括血小板源性生長因子（PDGF），成纖維細胞生長因子（FGF）及腫瘤壞死因子（TGF）-α信號通路通過酪氨酸蛋白激酶受體發揮作用。索拉非尼，是一種多種酪氨酸激酶受體抑制劑，可以靶向作用于PDGF受體及Raf/ERK信號通路，在動物模型中具有抗纖維化作用［12］。作為小分子酪氨酸激酶拮抗劑的伊馬替尼，也具有抗纖維化的作用［13］。體外培養的HSCs給予甲磺酸伊馬替尼處理后，其凋亡增加，增殖減少；CCl4小鼠肝纖維化模型給予甲磺酸伊馬替尼治療后可以緩解肝纖維化，促進肝再生［13］。

二、通過增強細胞外基質的降解促進肝纖維化的逆轉

肝纖維化時ECM合成和降解失衡，從而導致ECM的過度沉積，其中ECM降解由MMPs介導，而MMPs的活動由金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）調節［14］?；罨腍SCs除了I型膠原合成增加之外，TIMPs表達增加使ECM合成和降解失調并向合成增加的方向發展，引起組織纖維化［15］。TIMPs共有四種，在肝損傷中發揮作用的主要是TIMP-1［16］。許多研究發現TIMP-1不僅可以通過阻斷MMPs的功能阻止ECM的降解，而且能抑制活化HSCs的凋亡［17］。因此，抑制TIMP-1的表達將有助于促進肝纖維化的逆轉。

Cong等［18］通過構建以腺相關病毒為載體靶向作用于大鼠TIMP-1的小干擾RNA（rAAV/siRNA-TIMP-1）在抑制大鼠HSC-T6細胞系TIMP1基因的表達的同時可以使MMP-13表達增加。研究者又進一步證實了rAAV/siRNA-TIMP-1在大鼠肝纖維化模型中的作用。對CCl4和膽管結扎兩種大鼠肝纖維化模型給予rAAV/siRNA-TIMP-1治療發現能夠顯著減輕肝纖維化的程度，星狀細胞激活標志物α-SMA及TGFβ1水平均顯著降低，并且MMP13活性及表達水平顯著升高。rAAV/siRNA-TIMP-1治療通過直接提高MMP-13的表達及減少活化HSCs使細胞外基質降解增多，合成減少，進而減輕肝纖維化［19］。

目前認為，未充分交聯的膠原更易被內源性膠原酶和其他酶所降解。研究發現與正常組織相比，小鼠纖維化肝組織中膠原交聯酶賴氨酰氧化酶2（LOXL2）水平升高，對CCl4小鼠肝纖維化模型給予LOXL2單克隆抗體治療可以緩解肝纖維化，并使其p-Smad3表達水平顯著降低［20］。

因此抑制TIMP-1的表達或者封閉膠原纖維交聯酶的作用可能是一種有效的抗纖維化治療方法。

三、靶向作用于HSCs表達的蛋白促進肝纖維化的逆轉

（一）金屬硫蛋白（MT） MT是一種重要的鋅離子結合型蛋白，與鋅的代謝及穩態有關［21］，但近年來其在肝纖維化中的作用受到關注。

Jiang等［22］應用CCl4小鼠肝纖維化模型發現在肝纖維化進展期肝內MT表達水平降低，而在逆轉期肝內MT表達水平升高。敲除小鼠MT基因給予CCl4四周停藥后無纖維化的逆轉，對不可逆轉期肝纖維化模型及MT敲除肝纖維化模型小鼠給予以腺病毒為載體的人金屬硫蛋白IIA（h MT-IIA）基因治療可以使肝纖維化逆轉，促進肝細胞再生，推測MT在肝纖維化逆轉中發揮著重要作用。

Xu等［23］又進一步證實了h MT-IIA轉染對人肝星狀細胞中金屬蛋白酶表達改變的影響作用。人星狀細胞系LX-2在培養24小時后表達α-SMA、I型膠原增多，膠原酶表達水平降低，以質粒為載體將人MT-IIA基因轉染入活化的HSCs可以使其MT蛋白水平升高并伴隨α-SMA、I型膠原及其MRNA表達水平降低及金屬蛋白酶（MMP）1，8，13表達水平的升高。這說明HSCs活化狀態的逆轉，尤其是膠原酶表達水平的上調可能參與MT基因治療中肝纖維化的逆轉，但是其機制尚需進一步研究。

（二）N-乙酰葡糖胺轉移酶V（Gn T-V） 糖基化是真核細胞最常見的蛋白質翻譯后修飾作用之一，由高爾基體糖基轉移酶催化，因此糖基化異常主要由糖基轉移酶表達異常引起［24］。N-乙酰葡糖胺轉移酶V（Gn T-V）作為糖基轉移酶的一種，其在肝纖維化中的作用近年來備受關注。

最近有學者［25］通過腹腔注射CCl4或硫代乙酰胺（TAA）誘導的小鼠肝纖維化模型，發現在肝纖維化形成過程中肝內Gn T-V顯著升高。同時，激活的星狀細胞及損傷的肝細胞中Gn T-V表達上調。對CCl4或硫代乙酰胺（TAA）誘導的肝纖維化模型小鼠尾靜脈注射以腺病毒為載體靶向作用于Gn T-V的小干擾RNA（Ad MS1）可以緩解纖維化。體外對HSC-T6轉染Ad MS1，48-72小時后其促纖維化基因（I型膠原、αSMA、TIMP-1及波形蛋白）的表達水平顯著降低。此外，敲除星狀細胞中的Gn T-V基因可以減弱TGFβ/ Smad信號轉導并抑制HSCs的活化，并且可以通過阻斷PDGF/Erk信號通路進而抑制血小板源性生長因子介導的星狀細胞擴增及遷移。

因此，Gn T-V參與毒素誘導的肝纖維化進程，靶向作用于Gn T-V可能是治療肝纖維化的可行、有希望的方法。

四、刺激活化星狀細胞的凋亡促進肝纖維化逆轉

肌成纖維細胞的凋亡可以有效促進肝纖維化的逆轉，其抗凋亡蛋白如Bcl-2及轉錄因子如NF-kB表達的增加［26］，可以促進HSCs的生存。在動物模型中證實，NF-kB抑制劑膠霉毒素能夠促進肝纖維化的恢復，柳氮磺嘧啶與血管緊張素轉化酶抑制劑也可通過抑制NF-kB信號通路來降低肌成纖維細胞生存率從而具有抗纖維化的作用［26］。

NK細胞能夠清除活化的星狀細胞，因此，通過促進NK細胞的增殖將會有助于減輕肝纖維化。NK細胞活化后產生的IFN-γ，也是NK細胞抗纖維化的重要機制之一。盡管體液輸入IFN-γ在臨床試驗中并未取得滿意的效果，研究者仍更多地關注著受體介導的靶向活化的HSCs的IFN-γ治療方案［27］。

綜上所述，通過靶向阻斷HSCs受體-配體的相互作用、增強細胞外基質的降解、靶向作用于HSCs表達的纖維化相關蛋白及刺激活化星狀細胞的凋亡，均可促進肝纖維化逆轉。這些研究都為臨床肝纖維化治療提供了希望和思路。

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（本文編輯：馮珉）

·經驗交流·

收稿日期：（2015-09-10）

通信作者：叢敏，Email：mao mao0623@sina.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81370544），北京市自然科學基金（7142043），王寶恩肝纖維化基金（CFHPC0120131）