肝性腦病動物模型的研究進展

200032　上海　復旦大學上海醫學院(李政)；復旦大學附屬中山醫院消化科(石虹)

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·綜述·

肝性腦病動物模型的研究進展

李政石虹

200032上海復旦大學上海醫學院(李政)；復旦大學附屬中山醫院消化科(石虹)

肝性腦病(hepatic encephalopathy, HE)是由肝功能不全和/或門體靜脈分流(portal systemic shunting, PSS)所引起的大腦功能障礙，其神經或心理異常表現程度各異，輕者為亞臨床改變，重者可發生昏迷[1,2]。HE分為3種類型：A型HE為與急性肝功能衰竭相關的HE；B型HE為單純門體旁路所引起；C型HE是在慢性肝病患者中發生的HE，患者通常已進展至肝硬化，并建立了較為豐富的門體側支循環[3]。現就模型建立方法、機制、優缺點和行為學檢測等方面對三型HE的常用動物模型作一綜述。

一、A型HE動物模型

(一)非肝性動物模型

建模方法可采用肝斷流手術或全肝臟切除術。肝斷流手術中，肝臟被完整保留，但流入肝臟的血循環被轉道(門腔靜脈吻合)和阻斷(肝動脈結扎)；全肝臟切除術中肝臟被移除，內臟血循環轉道[4]。機制為通過切除肝臟或擾亂肝臟的血液循環造成肝功能衰竭。肝切除模型和肝斷流模型大鼠均會出現星型膠質細胞足突腫脹，肝斷流術后的大鼠腦水腫、血氨升高、顱內壓增高、其腦動作電位的表現和急性肝衰竭(acute liver failure, ALF)患者的表現相似[4]。由于24h死亡率較高，不利于療效的觀察，從而限制了這些模型的應用[5]。

(二)藥物誘導模型

1. 硫代乙酰胺(Thioacetamide, TAA)誘導的鼠模型：TAA誘導的ALF大鼠模型最早由Zimmermann等[6]建立。不同文獻選用的實驗動物、TAA劑量和給藥時間有所不同，如Sprague Dawley(SD)大鼠連續4天300 mg/kg腹腔注射[7]，雌性C57BL/6小鼠連續2天300 mg/kg腹腔注射[8]，或小鼠連續3天100 mg/kg腹腔注射[9]等。TAA被肝臟攝取后，經肝細胞內的細胞色素P450混合功能氧化酶代謝為TAA-硫氧化物，引起脂質過氧化反應和肝細胞損傷，并可直接作用于肝細胞DNA、RNA和蛋白質合成酶產生毒性作用，誘導肝代謝紊亂，致肝壞死[5]。TAA制備的HE模型具有良好的可重復性、易操作、成功率高、與人類HE相似度高等優點[10]。

2. 四氯化碳(CCl4)誘導的鼠模型：將CCl4按1∶4體積比溶于礦物油，按2.5 mL/kg劑量給予BALB/c裸鼠腹腔注射[11]。CCl4經肝微粒體細胞色素P450代謝激活, 生成活性自由基及一系列氧化活性物質, 與肝細胞質膜或亞細胞膜脂質發生過氧化反應, 降解膜磷脂, 破壞細胞膜完整性, 使其通透性增加, 致肝細胞壞死[5]。CCl4價格低廉；但實驗動物存活率低(24和48 h存活率分別為40%和10%)[12]。

3. D-氨基半乳糖(D-galactosamine, D-GalN)誘導的兔子模型：該模型的建立方法為將D-GalN溶于5%濃度的右旋糖溶液，按4.25 mmol/kg的劑量予以雄性新西蘭白兔耳靜脈注射。星形膠質細胞的損傷和功能受抑制是該模型HE的發生機制[13]。該模型可以重現星型膠質細胞水腫[13]，但實驗動物相對較貴。

4. 脂多糖和α-鵝膏蕈堿誘導的獼猴模型：將1 μg/kg脂多糖和0.1 mg/kg α-鵝膏蕈堿溶于50 mL的生理鹽水之中，緩慢注射到雌性恒河猴的腹腔中。脂多糖和α-鵝膏蕈堿先引起恒河猴肝細胞脂肪變性，最后發展成肝細胞大片壞死，爆發性肝功能衰竭。恒河猴模型與人類HE有相似的代謝和生理學特點[14]。但價格昂貴；迄今為止研究例數少，缺乏對比。

5. 氧化偶氮甲烷(azoxymethane, AOM)誘導的小鼠模型： 雄性C57Bl/6大鼠腹腔注射100 mg/kg AOM。AOM促進趨化因子配體2(chemokine ligand 2, CCL2)上調，CCL2與肝性腦病小膠質細胞的激活和神經功能下降相關[15]。該模型是研究急性肝損傷和肝性腦病的理想模型，具有可逆性、可重復性、具有治療窗等；但AOM對人體有生物毒性，實驗中還需注意對動物的體溫控制[16]。

二、B型HE動物模型

目前常用的建模方法是端-側門腔靜脈吻合術(porta-caval anastomosis, PCA)：結扎門靜脈近端，將門靜脈和下腔靜脈之間進行端-側吻合[17,18]。門腔靜脈分流引起腦組織中氨和谷氨酰胺增高，改變晝夜生物節律，使運動功能、記憶和學習能力減退，反射下降，降低腦的葡萄糖利用率，改變多種神經遞質功能[5]。改良的選擇性門腔靜脈端側吻合術是將腸系膜上靜脈和下腔靜脈行端-側吻合。選擇性門腔靜脈端-側吻合術與側-側門腔靜脈吻合使流入肝臟的門靜脈血流全部終止相比，只減少了其中的50%門靜脈血流；且術中靜脈更易暴露被找到，但為了確保血管不被拉伸和卷曲所花費的手術時間更長[19]。

三、C型HE動物模型

(一)有癥狀的C型HE模型

1. 藥物誘導模型：予以含TAA(初始濃度0.03%)的飲用水喂養Wistar大鼠12周，每周根據大鼠的體質量適當增減TAA的濃度[20]；或20周(濃度0.3 g/L或0.5 g/L)[21]。發病機制是通過改變在注意力和記憶力中起作用的腦邊緣系統區的乙酰膽堿脂酶活性[20]。TAA價格低廉；但藥物誘導的C型HE模型建模周期較長，建模過程中需注意監控動物體質量，適當增減藥物劑量。

2. 手術模型：在麻醉下結扎成年Wistar大鼠肝膽管匯合處以下和胰管開口以上的膽總管處，再將兩結扎處之間的膽總管切除[22,23]。膽管結扎(bile duct-ligated, BDL)大鼠大腦皮質中GABA神經遞質的合成改變，表現為自主活動的時空特點和探索性活動的改變，和短期識別記憶力的下降[22]。BDL可誘導可重復的膽汁性肝硬化大鼠模型，表現為肝功能衰竭、進行性黃疸、門脈高壓、門體分流、細菌移位以及免疫系統功能障礙；該模型大鼠雖然血氨升高，但僅表現為低級別的HE[4]。

3. 藥物和手術結合的C型HE模型

(1)BDL并輔以銨鹽喂食的大鼠模型：給予BDL術后的SD大鼠連續兩周喂食含質量百分比濃度為10%的乙酸銨的食物[24]。大鼠在肝病疾病和炎癥介質激活的背景下，氨作為誘發因素，引起嚴重的行為損傷。大鼠表現出與肝硬化HE患者相似的神經解剖學和神經化學特點，腦水腫和炎癥激活可以在這種情況下被發現[25]。

(2)CCl4誘導肝硬化結合門靜脈結扎的大鼠模型：SD 雄性大鼠每周予以含CCl4的飲用水灌胃，初始劑量為20 μL，以后每周根據體質量調整劑量，共6周；其后實施門靜脈結扎術。大鼠有輕度的腦水腫，肝再生結節和AlzheimerⅡ型星形細胞。該模型大鼠比肝硬化模型大鼠門體分流更明顯；同時比門靜脈結扎大鼠肝功能異常更明顯。能很好地重現肝硬化HE患者的主要癥狀：門體分流、血氨和腦氨水平增高、輕度腦水腫。缺點在于死亡率較高(67%)[26]。

(二)MHE的模型

1. 藥物誘導模型：SD雄性大鼠予以200 mg/kg TAA隔日腹腔注射，共兩次，MHE發生率為83.3%[27]；或雄性albino 大鼠予以50 mg/kg TAA腹腔注射，每周兩次，共14 d[28]；或SD大鼠予以200 mg/kg TAA腹腔注射，每周兩次，連續8周[29]。谷氨酸鹽-一氧化氮-環鳥酸苷通路中多巴胺受抑制導致MHE大鼠的記憶受損為其發病機制[29]。需通過腦誘發電位檢查是否建模成功[27]。

2. 手術模型：采用門靜脈校準狹窄術：雄性Wistar Kyoto大鼠在乙醚麻醉下，予以20號鈍針頭在門靜脈旁引導，用3號絲線結扎門靜脈；隨后移除針頭得到一個校準狹窄的門靜脈；通過門靜脈校準狹窄術大約能減少門靜脈66%的容積。術后10 d發生門靜脈高壓和高血氨癥，不伴有其他明顯的中樞神經系統改變，其分子學機制可能與海馬線粒體功能障礙和細胞凋亡有關[30]。該模型可以重現MHE高血氨的癥狀，但需精準地控制門靜脈的狹窄度，對于實驗者的手術技術要求較高。

四、HE模型行為學檢測方法

(一)強制游泳試驗實驗前1天，大鼠在室溫下，被放置在直徑24 cm，高50 cm的圓柱桶內，注入30 cm深的水，讓大鼠在其中活動10 min，將大鼠從桶中取出，在干凈的籠中干燥后放回飼養籠。24 h后，大鼠被再次放置在圓柱筒內，用攝像機監測大鼠5 min的行為，并計算大鼠不運動、游泳或試圖爬出圓筒這三項活動每項所用的時間[21]。

(二)新物體識別實驗第一天，大鼠被放置在直徑80 cm的圓形場地5 min以適應環境。第二天，在同一場地里放置兩個相同的物品，讓大鼠自由探索2 min。第三天，將其中一個物品替換成不一樣的物品，讓大鼠自由探索2 min，記錄其探索兩個物品的時間，并計算探索新物品的時間與探索兩個物品時間的比值，比值下降表示其記憶能力受損[21]。

(三)空間參考記憶的Morris水迷宮實驗該實驗在圓形的水箱中進行。大鼠會經過連續四天的訓練，將它們依次放入水中，給予其120 s時間尋找平臺，并在平臺上停留20 s。第五天，將平臺移開，每只大鼠進行四次實驗，每次有90 s的時間游泳，在原先平臺處停留的平均時間記錄為記憶再現指數[28]。

(四)旋轉實驗每只大鼠將進行每天5輪連續5 d的旋轉實驗。大鼠被放置在一個轉棒裝置上，轉棒的速度從第一天到第五天分別為5、10、15、20和25 rpm。每輪實驗會進行三次，每次間隔10 min，記錄三次實驗中大鼠在轉輪上停留的最長時間[28]。

(五)步態實驗大鼠的后爪被涂上墨水，在60 cm×10 cm紙帶上從光亮處走向黑暗處，測量并記錄左右爪之間的距離[28]。

(六)穿梭箱回避實驗大鼠被放置在一個雙向的穿梭箱中，內有設備可以產生非條件刺激(unconditioned stimulus, US)和條件刺激(conditioned stimulus, CS,電擊后亮燈)。每只大鼠在連續五天中接受五輪測試，每輪測試前，給大鼠5 min適應暗室，隨后進行30次試驗，每兩次間隔(30±5) s。CS中每次電擊前有20 s電燈點亮時間。US中，相當于CS的最后10 s時會以0.5 mA電流電擊大鼠10 s或至大鼠移動到箱子的另一側即停止。如果大鼠在CS中受到電擊前即移動到箱子另一側，則此次記錄為回避；如果大鼠受到刺激后做出反應，則記錄為逃脫；如果大鼠在刺激中不移至另一側，則記錄為無反應。分別記錄大鼠回避、逃脫和無反應的次數[28]。

(七)高架十字迷宮實驗高架十字迷宮組件由兩條相對開放臂(50 cm長×10 cm寬)和兩條相對閉合臂(50 cm長×10 cm寬×40 cm高)組成。裝置距離地面50 cm高，放置在紅光照明的房間正中。大鼠被放在裝備的中央，面向開放臂，自由探索5 min。分別記錄大鼠進入封閉臂的次數與進入兩組臂總次數的比值、于封閉臂處滯留時間與在兩組臂處滯留總時間的比值[31]。

(八)動物表現的臨床分級評分標準正常行為(0分)，輕度嗜睡(1分)，運動減少、姿勢控制困難和疼痛知覺減弱(2分)，嚴重的共濟失調、無自發翻正反射(3分)，無翻正反射、對疼痛刺激無反應(4分)[7]。

五、結語

A型HE模型的建立期望達到如下標準：可復制性，并易于觀察分期；癥狀的進展包括腦水腫及其并發癥(顱內高壓及腦疝)；潛在的可逆轉性；高血氨/腦氨、谷氨酰胺增加；肝臟、腦組織的病理變化具有特征性；對實驗人員具有最小的毒性。B和C型HE大鼠模型期望達到的標準為：門體分流或慢性肝病伴門體分流；腦病的癥狀從輕微型HE到昏迷；腦病昏迷階段AlzheimerⅡ型星形細胞增生；血氨、腦氨和谷氨酰胺濃度升高；存在誘發因素；對治療手段有可觀察的臨床反應[4]。根據研究目的合理選擇并進一步完善合適且穩定的HE動物模型對于進一步闡明HE的發病機制和尋求新的治療方法十分重要。

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(本文編輯：張苗)

(收稿日期：2015-08-31)

通信作者：石虹，Email: shi.hong@zs-hospital.sh.cn

基金項目：國家基礎科學人才培養基金項目J1210041 (批準號：NSFC grant J1210041)