熒光定量PCR在結核菌快速檢測中的應用分析

杜安玲

(安陽市結核病防治所　河南 安陽　455000)

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熒光定量PCR在結核菌快速檢測中的應用分析

杜安玲

(安陽市結核病防治所河南 安陽455000)

目的探討熒光定量PCR在結核菌快速檢測中的應用效果。方法選取安陽市結核病防治所2014年6月至2014年12月就診的100例呼吸系統疾病患者(臨床陽性痰分離株100份)，應用熒光定量PCR技術檢測。結果熒光定量PCR檢測準確率為97%，菌種鑒定特異性實驗符合率為100%。結論結核菌快速培養法如熒光定量PCR技術經濟、簡單，結果可靠，特異度和敏感性均居較高水平，鑒別診斷能力較強，實驗室可據自體條件對不同的檢測方法進行選擇。

結核菌；熒光定量PCR；快速檢測

近年來，受多種因素影響，結核病發病率有上升表現，我國屬結核病高負擔國家，對公眾生命安全構成了嚴重影響。結核病快速檢測可為診治提供依據，是加強防控效果的關鍵[1]。本次選取相關病例，依據需要，應用熒光定量PCR檢測，現將相關內容總結如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選取安陽市結核病防治所2014年6月至2014年12月就診的100例呼吸系統疾病患者(痰液標本陽性)，年齡20～60歲，平均(45.2±5.8)歲，男62例，女38例。

1.2檢測方法應用熒光定量PCR試劑盒(美國原裝進口)和熒光定量PCR儀；取受試對象清晨痰液，以等體積的NaOH(4%)加入，在室溫下液化30 min，若溶液仍黏稠，取出部分痰液，再取4倍體積NaOH(4%)加入；在生物安全柜內將液化標本取出1 ml左右，12 000 r/min離心5 min，棄上清，重復操作，加入核酸提取液50 μl，混勻，使沉淀物懸浮，100 ℃置樣管10 min，后放置4 ℃環境下冷卻，離心2 min，吸取上清，將反應模板保存在4 ℃環境中。依據PCR反應體系配置，設置測試循環，94 ℃、2 min，94℃、15 s，72 ℃、40 s，55 ℃、15 s，共40個循環，在實驗前調整增益值，完成擴增程序。

1.3觀察指標統計PCR檢測結果，并計算其準確率和特異性實驗符合率。

2　結果

熒光定量PCR檢測準確率為97%，菌種鑒定特異性實驗符合率為100%。

3　討論

傳統結核桿菌培養方法時間較長，為2～3個月，增加了防控、治療藥物選擇、結核病診斷的難度。在世界范圍內，快速診斷結核病的方法均已成為關注的焦點，快速診斷技術近年的研發和應用也為耐藥結核和不典型結核診治提供了較大幫助，本文就快速檢測結核菌及耐藥菌技術加以探討。

結核桿菌培養方法： ①液體培養法：在液體培養基中，結核桿菌生長速度較快，設備、方法均較簡單，故在中低收入國家，WHO推薦應用此方法完成相關檢驗。如分枝桿菌快速手工培養，不管對一或二線藥物，行藥敏測試均有效、精確、簡單。檢測異煙肼和利福平敏感性的準確率在90%以下，結果7～14 d即獲得[2]。應用MGIT960自動培養系統，其工作原理與分枝桿菌快速手工培養相同，但熒光信號讀取和培養由儀器按事先設計程序自動控制。對此系統測定結果薈萃分析，預測值和精確性均居較高水平，用二線藥敏試驗，結果與放射測量法一致[3]。此方法檢測氧氟沙星特異性和敏感性均達100%，效果較理想，但設備需資金，儀器最大工作負荷對樣品量有所限制，在小規模實驗室中適合應用。具體技術：a.The BacT/Alert 3D系統，應用改良肉湯培養基(7H9 Middlebrook)，取比色傳感器裝在試管底部，能感受細菌代謝產生的CO2，由綠向黃色轉換，儀器對顏色變化自動持續監測。此系統在結核菌快速培養中有較好的藥敏檢測特異度和靈敏度。b.The Versa TREK系統，應用肉湯培養基(富含7H9 Middlebrook)，細菌代謝在一定程度上使培養容器內壓力出現變化，可監測壓力變化和細菌生長情況，在同一裝置內完成培養和檢測。c.顯微鏡對肉湯-藥敏觀察測試，結核桿菌生長過程中有特征性的繩帶形成，在24孔板中用液體培養基(含或不含抗生素)對細菌培養，應用倒置顯微鏡對結核菌特征性Cord相關形成情況用40倍鏡頭觀察。對MODS測試異煙肼和利福平的敏感性薈萃分析，涂陽痰標本特異性為96%，結果在平均21 d時即100%得出，操作較為簡單。d.比色氧化還原指標劑法，在培養基(含或不含抗結核藥)中放置氧化還原指示劑，培養基顏色在細菌生長時有改變，對兩管培養的顏色對比，可對結核菌是否耐藥進行判斷。對耐藥性監測進行薈萃分析表明，特異性和敏感性均居較高水平。臨床有多種氧化還原指示劑，可依據不同藥物對相對敏感的指示器進行選擇。e.載玻片培養技術，在載玻片培養基礎上加強改進的一種新型快速培養技術，在滅菌載玻片一端將10個樣品涂片縱切成兩半，放入培養瓶(7 ml液體培養基)，取不含抗結核藥的3瓶作對照，其他瓶做藥敏試驗(含抗結核藥)，在冰箱中過夜，將培養瓶在次日由培養箱中移入，培養10 d。載玻片取出后干燥，染色，顯微鏡下觀察抗酸菌落。當對照組菌落最少有1個，藥敏組仍有菌落時，即產生耐藥。此法對利福平的精確度為96%，對異煙肼的精確度為90%。此方法原理較為簡單，但操作復雜。②固定培養措施：a.TK培養基結核菌快速培養系統，結核桿菌代謝活動可促使培養基色澤發生改變，可在形成細菌菌落前依據培養基顏色對分枝桿菌是否生長加以鑒定。方法經濟、簡單，出結果時間較常規培養縮短10 d。該技術可排除常見細菌污染，對非結核與結核分枝桿菌進行鑒別，完善質量控制，規范應用條件，為一種有前途、實用的措施。b.噬菌體法，采用噬菌體生物擴增法快速檢測結核菌，對基本原理進行分析，在含結核分枝桿菌待測樣品中引入特異性裂解分枝桿菌噬菌體，噬菌體能感染活分枝桿菌，多余的未進入菌體的噬菌體加入消毒劑中滅活，已入菌體內的噬菌體未受相關影響[4]。在受感染分枝桿菌內，噬菌體大量繁殖并裂解菌體，有大量子代噬菌體釋放，可感染隨后加入的相關指示細胞并對其裂解，觀察瓊脂平板培養基，有透明噬菌斑出現。依據噬菌斑數量對標本中有無活結核分枝桿菌進行判斷[4]。

本研究應用DNA探針對臨床標本直接鑒定，可對鳥結核分枝桿菌、復合結核桿菌進行辨別，結果示，熒定量PCR檢測準確率為97%，菌種鑒定特異性實驗符合率為100%。

綜上，結核菌快速培養法經濟、簡單，結果可靠，但獲取結果時間仍需10～20 d。核酸擴增1～2 d或幾小時均可得到結果，有較高的特異度和敏感性，鑒別診斷能力較強，實驗室可仍據自體條件對不同的檢測方法進行選擇。

[1]周華.耐藥結核菌檢測技術的國內研究進展[J].貴州醫藥,2012,36(3):279-280.

[2]張西雁,張春智,陳剛,等.依賴利福平結核菌肺結核一例分析[J].中華傳染病雜志,2008,26(2):110-111.

[3]張娟,孫炳奇,孫嬌,等.兩種基因診斷技術對結核分枝桿菌耐藥性檢測效果比較[J].實用醫學雜志,2014,30(9):1482-1485.

[4]趙麗,趙緒永,陳紅英,等.PPV SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應用[J].西北農林科技大學學報(自然科學版),2012,40(5):19-23.

R 446.5doi: 10.3969/j.issn.1004-437X.2016.09.094

2015-12-27)