PCR-變性梯度凝膠電泳技術分析肺炎兒童下呼吸道菌群多樣性

黃君華，武永紅，張書婉

（1.西安醫學院醫學技術系，陜西 西安 710021；2.西安市兒童醫院檢驗科，陜西 西安 710003）

PCR-變性梯度凝膠電泳技術分析肺炎兒童下呼吸道菌群多樣性

黃君華1，武永紅1，張書婉2

（1.西安醫學院醫學技術系，陜西 西安 710021；2.西安市兒童醫院檢驗科，陜西 西安 710003）

目的 初步探討PCR-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)檢測肺炎兒童下呼吸道菌群多樣性的作用。方法收集10份培養陽性的患兒肺泡灌洗液2～5 mL，經細菌DNA提取、16S rDNA-PCR后進行變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析，對優勢條帶進行測序。結果經培養10份標本中7份鑒定為一種菌感染，3份培養出兩種病原菌；經PCR-DGGE分析8份標本出現多條明顯條帶，2份得到一條條帶，共篩選出12個優勢條帶；DGGE法得到的細菌種類多于培養法。結論PCR-DGGE可較好地鑒定混合細菌感染性肺炎病原菌并能檢測到培養法沒有檢出的細菌；兒童肺炎主要以肺炎鏈球菌、大腸埃希菌、草綠色鏈球菌等病原菌為主。

肺炎；變性梯度凝膠電泳；菌群多樣性；兒童

肺炎是兒童常見的感染性疾病之一，也是我國嬰幼兒死亡的首要原因[1]。其中多重細菌感染引起的肺炎數量日益增多，成為難治性肺炎和細菌耐藥的主要原因[2]。目前國內外對肺炎的病原學診斷主要是痰培養，敏感度低，導致許多混合或潛在的病原菌無法檢出。本文采用深部吸痰法采集患兒的下呼吸道標本，分別經培養和變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析，探討PCR-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)檢測混合細菌感染性肺炎的能力及感染狀態下兒童下呼吸道的菌群多樣性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 采用深部吸痰法從西安市兒童醫院收集10份痰標本，每份標本2～5 mL。

1.2 方法

1.2.1 下呼吸道標本培養 用無菌棉拭子將標本均勻涂布于血平板上，經18～24 h培養，挑取可疑菌落用VITEK compact分析儀進行鑒定。

1.2.2 細菌總DNA提取 涂布平板后剩余痰標本經1 2000 rpm離心5 min，取沉淀，應用QIAamp Blood DNAMini Kit(QIAGEN，德國)，操作步驟按照說明書。

1.2.3 PCR擴增 選擇16S rDNA-V3區進行擴增，引物序列參照Muyzer等[3]設計，擴增產物193 bp。50μL PCR擴增體系，包括：5μmol/L上下游引物各2μL，10×buffer 5μL，10 mmol/LdNTP1μL，2.5 mmol/L MgCl25μL，Taq酶(5 U/μL)0.4μL，DNA模板4μL，ddH2O 30.6μL。PCR反應采用touchdown PCR，參考文獻[3]。

1.2.4 DGGE 采用Bio-Rad DcodeTMUniversal Mutation系統對PCR產物進行電泳。聚丙烯凝膠濃度8%，變性梯度范圍30%～65%。具體步驟見文獻[4]。

1.2.5 條帶回收、克隆、測序 用無菌刀片切下優勢條帶放于Ep管，99℃金屬浴20 min回收DNA，然后以管中液體為模板，用相同引物再次擴增。擴增產物送上海生工公司測序，登陸http://www.ncbi.nlm.nih. gov/blast/Blast.cgi，將測序結果進行BLAST比對。

2 結 果

2.1 培養結果 經培養10份標本中7份鑒定為一種菌感染，3份培養出兩種病原菌，具體結果見表1。

2.2 PCR-DGGE圖譜 DGGE分析8例標本得到多條明顯條帶，2份僅有一條條帶(圖1)；10份肺炎共鑒定出12條優勢條帶，經測序比對細菌種類見表2。

表1 下呼吸道標本培養和DGGE分析結果

表2 DGGE回收細菌DNA片段比對結果及出現頻率

圖1 肺炎兒童下呼吸道標本DGGE圖譜

3 討 論

近年來，PCR-DGGE技術常被用于人體菌群微生態的分析，如腸道菌群[5]、皮膚菌群[6]、闌尾炎組織[7]等，可很好地檢測出這些人體部位的優勢菌群；并且在檢測混合細菌感染方面也表現出良好的作用[4]。本研究應用該技術分析肺炎兒童的下呼吸道標本，既可以檢測下呼吸道的混合感染病原菌，同時又可以分析肺炎狀態下的菌群多樣性，對病原學的快速診斷和難治性肺炎的耐藥問題具有一定的提示作用，可謂“一舉雙得”。

正常情況下，人體的下呼吸道是無菌的，若有細菌侵入則可能造成感染。本研究在無菌條件下采用深部吸痰法[8]采集標本，保證了標本采集過程中不會被上呼吸道的正常菌群污染。混合細菌感染性肺炎是近年來比較常見的多發病，發生率較高[2]，臨床表現嚴重，治療效果較差[9]，細菌耐藥情況嚴峻，由此形成的難治性肺炎的治療常常棘手，早期快速的病原學診斷尤為重要。但目前多重病原菌感染性肺炎的研究多集中在成年人，尤其是老年患者，而針對兒童肺炎的混合細菌感染報道較少。本研究應用PCR-DGGE分析標本，從檢測速度上要比傳統的痰培養法提前1～2 d，從細菌檢測的種類上可比培養法多檢測出1～2種，可見該分子生物學方法較培養方法更快速更全面。

從實驗結果可知，有3份標本培養法僅得到兩種菌，而DGGE法得到三種菌(檢出草綠色鏈球菌或干燥奈瑟菌)；有5份標本培養法僅得到一種菌，而DGGE法得到兩種或三種菌，其中檢出了副流感嗜血桿菌、溶血葡萄球菌、大腸埃希菌、卡他莫拉菌、洛菲不動桿菌等致病菌。可見兒童肺炎常由多種病原菌引起，但這種情況往往因培養方法的局限性或工作人員對菌落判斷的主觀性而沒有被檢出。此外，由結果可知兒童肺炎混合感染的病原菌主要是肺炎鏈球菌合并其他細菌感染，最常見的是肺炎鏈球菌+大腸埃希菌+草綠色鏈球菌。這與成年人肺炎的混合感染菌譜是不同，主要是肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌[2]。這種混合細菌的存在往往給治療帶來困難，主要是細菌耐藥問題，本文A、C、F、I四個病例均對青霉素、頭孢曲松、頭孢噻肟耐藥，但這幾份樣本僅培養出肺炎鏈球菌，是否混合狀態導致了多重耐藥尚需進一步研究。

綜上所述，PCR-DGGE結合測序在檢測多重細菌感染性肺炎時較培養方法快速全面，且對研究混合感染時的細菌耐藥具有提示意義。

[1]譚文濤,笪欣.細菌培養和聚合酶鏈反應在肺炎患兒細菌病原學檢測中的應用價值[J].中國實驗診斷學,2015,19(1):98-100.

[2]蔣超英,韓丙超,李仕英.呼吸內科混合細菌感染調查分析[J].臨床肺科雜志,2013,18(10):1774-1776.

[3]Muyzer G,de Waal EC,Uitterlinden AG.Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA [J].Appl Environ Microbiol,1993,59(3):695-700.

[4]黃君華,張書婉,張寧.PCR-DGGE結合測序在檢測混合細菌感染中的價值[J].海南醫學,2014,25(8):1154-1156.

[5]Wu X,Ma C,Han L,et al.Molecular characterisation of the faecal microbiota in patients with type 2 diabetes[J].Curr Microbiol,2010, 61(1):69-78.

[6]Li W,Han L,Yu P,et al.Nested PCR-denaturing gradient gel electrophoresis analysis of human skin microbial diversity with age[J].Microbiol Res,2014,169(9-10):686-692.

[7]楊靜麗,余加林,王政力,等.16SrDNA變性梯度凝膠電泳技術與臨床培養方法對比分析兒童闌尾炎組織菌群多樣性[J].中國循證兒科雜志,2014,9(1):23-27.

[8]Lu W,Yu J,Ai Q,et al.Increased constituent ratios of Klebsiella sp, Acinetobacter sp,and Streptococcus sp,and a decrease in microflora diversity may be indicators of ventilator-associated pneumonia:a prospective study in the respiratory tracts of neonates[J].PLoS One, 2014,9(2):e87504.

[9]李子玉,李俊華,趙愛華.混合細菌感染性肺炎46例臨床分析[J].河南醫藥信息,2000,8(4):3-4.

PCR-denaturing gradient gel electrophoresis analysis of lower respiratory tract microbial diversity in children with pneumonia.

HUANG Jun-hua1,WU Yong-hong1,ZHANG Shu-wan2.1.Department of Medical Technology,Xi'an Medical University,Xi'an 710021,Shaanxi,CHINA;2.Department of Clinical Laboratory,Xi'an Children's Hospital,Xi'an 710003,Shaanxi,CHINA

ObjectiveTo explore the value of PCR-denaturing gradient gel electrophoresis(PCR-DGGE) in analysis of lower respiratory tract microbial diversity in children with pneumonia.MethodsA total of 10 bronchoalveolar lavage fluid samples which has been identified bacterial infection by culture were included.The bacterial DNA was extracted,and 16S rDNA-V3 was amplified,following by DGGE,sequencing the predominant bonds and BLAST.ResultsIn the 10 samples,there was one bacterium in 7 samples,two bacteria in 3 samples by bacterial culture.There were multiple bonds in 8 samples by DGGE,and a total of 12 predominant bonds were identified.DGGE method can detect more bacterial species than bacterial culture method.ConclusionPCR-DGGE can identify mixed bacteria which caused pneumonia and detect the pathogen that cannot be detected by bacterial culture.The pneumonia in children is mainly caused by Streptococcus pneumoniae,Escherichia coli,Streptococcus viridans.

Pneumonia;DGGE;Microbial diversity;Children

R725.6

A

1003—6350（2016）10—1585—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.10.012

2016-01-14)

西安醫學院青年科研基金項目（編號：2015QN09）

黃君華。E-mail：huangjunhua1985@163.com