DDR1促進胰腺癌細胞AsPC-1的遷移及侵襲能力

楊佳純，張毅，曹佳，徐雷鳴

(上海交通大學醫學院附屬新華醫院消化內科，上海200092)

DDR1促進胰腺癌細胞AsPC-1的遷移及侵襲能力

楊佳純，張毅，曹佳，徐雷鳴

(上海交通大學醫學院附屬新華醫院消化內科，上海200092)

目的探討盤狀結構域受體1(DDR1)對胰腺癌細胞遷移及侵襲能力的影響。方法利用qRT-PCR檢測DDR1在胰腺癌旁組織及癌組織中的表達水平。通過脂質體轉染DDR1表達質粒至胰腺癌細胞AsPC-1中，應用Western blot驗證其轉染效果。通過劃痕實驗及Transwell法檢測轉染DDR1表達質粒后細胞遷移及侵襲能力的變化情況。Western blot檢測轉染后基質金屬蛋白酶2(MMP2)和基質金屬蛋白酶9(MMP9)的表達水平。結果與癌旁組織比較，胰腺癌組織的DDR1 mRNA表達水平顯著升高(P＜0.05)。轉染質粒后，AsPC-1細胞DDR1蛋白表達量顯著升高(P＜0.05)。應用劃痕試驗及Transwell試驗結果顯示，與對照組比較，AsPC-1/DDR1遷移力上調(51.11±11.51)%，侵襲力上調(77.25±10.64)%，差異均具有統計學意義(P＜0.05)。過表達DDR1后，AsPC-1細胞中MMP2和MMP9表達水平顯著升高(P＜0.05)。結論DDR1通過改變MMP2和MMP9的表達水平，促進胰腺癌細胞的遷移及侵襲，有望成為靶向治療的新方向。

盤狀結構域受體1；胰腺癌；遷移；侵襲；基質金屬蛋白酶2；基質金屬蛋白酶9

胰腺癌是消化系統惡性程度極高的腫瘤之一，其發病率和病死率逐年升高，五年生存率通常不超過5%。并且，多數患者確診時已處于中晚期，常伴有淋巴結或遠處轉移，手術切除率低，復發率高。因此，深入研究胰腺癌發生發展機制，在分子靶向治療方面取得新的成果，對提高患者的生存時間具有重要的意義[1-3]。

盤狀結構域受體1(Discoidin domain receptor 1，DDR1)作為一種受體型酪氨酸激酶，在許多惡性腫瘤中異常表達。其主要通過調控膠原蛋白的合成和降解，參與癌細胞的增殖、遷移、侵襲和基質重塑[4]。因此，本研究通過DDR1過表達質粒轉染至AsPC-1中，觀察其對胰腺癌細胞的遷移及侵襲能力的影響以及對基質金屬蛋白酶2(MMP2)和基質金屬蛋白酶9 (MMP9)表達情況的影響，探討DDR1是否通過調節基質金屬蛋白酶的表達，參與胰腺癌細胞的遷移及侵襲。

1 材料與方法

1.1 細胞株及實驗材料人胰腺癌細胞AsPC-1購于上海中國醫學科學院細胞庫。RPMI-1640培養基，0.25%胰蛋白酶，胎牛血清均購于美國Gibco公司。LipofectamineTM2000購于美國Invitrogen公司。pcDNA3.1/DDR1質粒購于上海吉凱基因化學技術有限公司。Matrigel基質膠購于美國BD公司。Transwell購于美國Corning公司。兔抗人單克隆抗體DDR1購于美國CST公司。兔抗人多克隆抗體MMP2、兔抗人多克隆抗體MMP9均購于美國Santa Cruz公司。逆轉錄及real-time PCR試劑盒購于日本Takara公司。

1.2 細胞培養人胰腺癌細胞AsPC-1在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中培養、傳代。放置于37℃，5%CO2恒濕培養箱中常規培養。

1.3 DDR1質粒轉染當細胞培養至密度為70%～80%時進行轉染。采用脂質體轉染法，具體操作流程參照Lipofectamine2000說明書。轉染72 h后提取蛋白，進行Western blot檢測。

1.4 Real-time PCR法按照試劑盒說明書抽提細胞總RNA并逆轉錄合成cDNA。基因表達通過2′-△△CT方法進行計算。實驗重復3次。引物：DDR1上游：5′-GGTGCTGATGCTCTGTAGGG-3′；DDR1下游：5′-CGTGTTGAGTGCATCCTCTG-3′。

1.5 Western blot法將細胞加至含有PMSF的蛋白裂解液，冰上放置45 min，低溫離心，提取上清。并根據BCA法進行蛋白濃度測定。取60～80 μg總蛋白，配制10%聚丙烯酰胺凝膠，80 V 120 min進行電泳。轉膜條件為300 mA 100 min。含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉2.5 h，TBST洗3遍，加入DDR1抗體(1:1 000)，MMP2抗體(1:500)，MMP9抗體(1:200)及tubulin抗體(1:1 000)，4℃冰箱過夜，TBST洗3遍，分別加入相應二抗(1:1 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜3遍，ECL發光液發光。

1.6 細胞劃痕實驗將AsPC-1細胞接種于12孔板，轉染后用100μl的槍頭做十字劃痕，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2遍，加入正常培養基常規培養，分別于0 h、24 h、48 h、72 h拍照。

1.7 細胞遷移及侵襲力檢測轉染24 h的AsPC-1細胞消化離心，無血清培養基洗滌細胞1次后用無血清培養基重懸細胞，調整細胞數為2×105/ml。每孔上室加入100μl，下室加入500μl含2%胎牛血清的RPMI-1640培養基，37℃培養箱內孵育24～36 h后取出小室，棄去培養基，用棉簽蘸清水擦拭小室內的殘余細胞。甲醇固定30 min，結晶紫染色10 min，顯微鏡下拍照并隨機計算8個視野穿膜細胞數。Transwell小室包被Matrigel基質膠80μl(1:4稀釋)，37℃孵育6 h。在上室及下室均加入500μl無血清培養基置4℃過夜。余步驟同細胞遷移實驗。

1.8 統計學方法應用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，計量資料均以均數±標準差(±s)表示，實驗重復3次。兩組實驗均數比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 胰腺癌及癌旁組織DDR1的表達水平qRT-PCR結果示，胰腺癌組織中DDR1的表示水平顯著高于癌旁組織(P＜0.05)，見圖1。

圖1 qRT-PCR檢測DDR1 mRNA在胰腺癌癌旁組織及癌組織中表達情況

2.2 DDR1轉染AsPC-1后蛋白表達水平DDR1表達質粒轉染AsPC-1，AsPC-1/DDR1的相對蛋白表達量為(2.55±0.55)，顯著高于對照組(P＜0.05)，見圖2。

圖2 Western blot檢測DDR1質粒轉染后的表達情況

2.3 DDR1過表達后AsPC-1細胞遷移能力變化與對照組比較，DDR1質粒組在0 h、24 h、48 h、72 h的胰腺癌細胞AsPC-1遷移能力顯著提高，見圖3。Transwell實驗結果示，與對照組比較，AsPC-1細胞遷移力上升(51.11±11.51)%，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見圖4。

圖3 劃痕實驗檢測DDR1質粒轉染后對細胞體外遷移能力的影響

圖4 Transwell檢測DDR1質粒轉染后對細胞體外遷移能力影響

2.4 DDR1過表達后AsPC-1細胞侵襲能力變化采用侵襲實驗表明，與對照組比較，DDR1表達上調后穿膜細胞數顯著增加，AsPC-1細胞侵襲力增加(77.25±10.64)%，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見圖5。

圖5 DDR1質粒轉染后對細胞體外侵襲能力的影響

2.5 DDR1過表達后AsPC-1細胞MMP2、MMP9表達情況Western blot實驗檢測轉染后MMP2和MMP9的表達情況，結果表明，與對照組相比，AsPC-1/ DDR1組的MMP2和MMP9蛋白水平顯著升高，見圖6。

圖6 Western blot檢測DDR1質粒轉染后對MMP2和MMP9表達的影響

3 討論

腫瘤的侵襲轉移是一個復雜的級聯過程。胰腺癌作為一種消化系統的惡性腫瘤，具有發病隱匿、轉移早、進展快、預后非常差的特點。因此，進一步研究與胰腺癌侵襲轉移密切相關的基因，探討其發生發展機制，為今后靶向治療提供理論依據[5]。

DDR1作為一種酪氨酸激酶，對腫瘤的發生發展起著至關重要的作用，其可以通過與腫瘤細胞周圍膠原蛋白相互作用，降解細胞外基質，促進侵襲和轉移[6-7]。在胰腺癌方面，研究發現，DDR1異常表達于胰腺癌患者中，且與其預后有著密切的關系[8]。在機制方面，I型蛋白膠原可以與DDR1或整合素相互作用，通過p130CAS-Rap1-MLK3-MKK7-JNK1-cJun信號通路，上調N-cadherin的表達，促進胰腺癌細胞擴散[9]。COLXV通過與DDR1相互結合，直接作用于E-cadherin，抑制COLI介導的細胞散射，從而調節胰腺癌細胞的侵襲能力[10]。在DDR1治療方面，研究人員發現了一種選擇性DDR1抑制劑——DDR1-IN-1，其可抑制DDR1發生自身磷酸化，促進腫瘤細胞的凋亡，有望成為DDR1過表達或突變的腫瘤治療探針[11]。可見，DDR1在胰腺癌發展過程中起著十分重要的作用。

本研究將DDR1表達質粒轉染入AsPC-1細胞中，旨在研究外源性過表達DDR1對胰腺癌細胞遷移及侵襲的影響。研究發現，與癌旁組織比較，DDR1過表達于胰腺癌組織中。胰腺癌細胞過表達DDR1后，MMP2和MMP9的表達亦顯著升高，促進AsPC-1的遷移及侵襲能力。

綜上所述，在胰腺癌細胞中，DDR1通過調節MMP2和MMP9的表達增強其遷移及侵襲能力。

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Up-regulating effect of DDR1 on migration and invasion of human pancreatic cancer cell line AsPC-1.

YANG Jia-chun,ZHANG Yi,CAO Jia,XU Lei-ming.Department of Gastroenterology,Xin Hua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200092,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of discoidin domain receptor 1(DDR1)on the migration and invasion of human pancreatic cancer cell line AsPC-1.MethodsThe expressions of DDR1 mRNA in pancreatic cancer tissues and adjacent tissues were determined by real-time PCR.The expressions of DDR1,matrix metalloproteinase 2 (MMP2)and matrix metalloproteinase 2(MMP9)were detected by Western blot after the DDR1 expression plasmid was transfected into AsPC-1 cell line.The ability of migration and invasion was determined by Wound Healing and Transwell.ResultsThe expression of DDR1 mRNA in pancreatic cancer tissues was significantly higher than that in adjacent tissues(P＜0.05).After the DDR1 plasmid was transfected into AsPC-1,the protein expression of DDR1 was significantly up-regulated(P＜0.05).Compared with cells transfected with empty vector(control),the ability of migration and invasion for cells transfected with DDR1 plasmid were increased by(51.11±11.51)%and(77.25±10.64)%,and the expression levels of MMP2 and MMP9 after overexpression of DDR1 were also significantly up-regulated.The differences were all statistically significant(P＜0.05).ConclusionDDR1 can promote the migration and invasion of human pancreatic caner cell line AsPC-1 via up-regulating the expressions of MMP2 and MMP9.It could be considered as a potential target for gene therapy for pancreatic cancer.

Discoidin domain receptor 1(DDR1);Pancreatic cancer;Migration;Invasion;Matrix metalloproteinase 2(MMP2);Matrix metalloproteinase 2(MMP9)

R735.9

A

1003—6350（2016）02—0173—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.02.001

2015-09-21)

國家自然科學基金青年科學基金(編號：81301826)

徐雷鳴。E-mail：leiming.xu@aliyun.com；曹佳。E-mail：76333336@qq.com。