HBV相關(guān)慢加亞急性肝衰竭患者中Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞的變化及其與肝功能和HBV-DNA載量間的研究

沈敏，林明強(qiáng)，馮奇桃，呂友凱，李永武

(海南省農(nóng)墾總醫(yī)院感染性疾病科1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室2，海南 海口 570311)

HBV相關(guān)慢加亞急性肝衰竭患者中Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞的變化及其與肝功能和HBV-DNA載量間的研究

沈敏1，林明強(qiáng)1，馮奇桃1，呂友凱1，李永武2

(海南省農(nóng)墾總醫(yī)院感染性疾病科1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室2，海南 海口 570311)

目的 通過(guò)檢測(cè)乙型肝炎病毒(HBV)相關(guān)慢加亞急性肝衰竭(HBV-ACLF)患者外周血中的Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞的水平，探討Th17、Treg細(xì)胞在HBV-ACLF發(fā)病機(jī)制中的作用。方法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)22例HBV-ACLF患者、24例慢性乙型肝炎患者（CHB）以及20例健康對(duì)照者(HC)外周血Th17、Treg細(xì)胞的頻率，熒光定量PCR法檢測(cè)患者外周血HBV-DNA水平，同時(shí)分析Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞、Th17/Treg與谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(TB)及HBV-DNA載量間的相關(guān)性。結(jié)果HBV-ACLF組患者的Thl7細(xì)胞、Treg細(xì)胞、Th17/ Treg較CHB組和HC組明顯增高，CHB組又較HC組Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞、Th17/Treg升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；HBV-ACLF組外周血中Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞間存在正相關(guān)(r=0.873，P＜0.05)，CHB組外周血中Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞間存在正相關(guān)(r=0.638，P＜0.05)，HC組外周血中Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞間存在正相關(guān)(r=0.617，P＜0.05)。HBV-ACLF組Thl7細(xì)胞與ALT呈正相關(guān)(r=0.612，P＜0.05)，Th17/Treg與ALT呈正相關(guān)(r=0.592，P＜0.05)；CHB組Thl7細(xì)胞與ALT呈正相關(guān)(r=0.636，P＜0.05)，Th17/Treg與ALT呈正相關(guān)(r=0.712，P＜0.05)。HBV-ACLF組、CHB組和HC組Th17、Treg、Th17/Treg與AST和TB間無(wú)相關(guān)性。HBV-ACLF組和CHB組Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞、Th17/Treg與HBV-DNA載量間無(wú)相關(guān)性。結(jié)論Thl7細(xì)胞和Treg細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)可能處于一種平衡狀態(tài)，在CHB和HBV-ACLF體內(nèi)這種平衡可能已經(jīng)打破。Thl7細(xì)胞、Treg細(xì)胞可能參與了慢性乙型肝炎和HBV相關(guān)慢加亞急性肝衰竭的發(fā)生發(fā)展，同時(shí)，Th17細(xì)胞有望成為評(píng)估HBV-ACLF患者肝臟損傷程度的一個(gè)免疫學(xué)指標(biāo)。Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞與HBV-DNA載量無(wú)相關(guān)性。

Th17；Treg；HBV；慢加亞急性肝衰竭；谷丙轉(zhuǎn)氨酶；谷草轉(zhuǎn)氨酶

目前全球約有4億人感染乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)，而這4億慢性HBV感染者中有約 1/3在中國(guó)[1-2]，HBV相關(guān)慢加亞急性肝衰竭(Acute-on-chronic liver failure，HBV-ACLF)是在HBV感染的基礎(chǔ)上引起的肝臟急性炎癥壞死反應(yīng)，臨床上可以出現(xiàn)消化道出血、自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎、肝腎綜合征、肝性腦病等并發(fā)癥。目前，HBV-ACLF缺乏特異的治療手段，臨床上仍以內(nèi)科綜合治療為主，預(yù)后差，死亡率高。關(guān)于HBV-ACLF的具體發(fā)病機(jī)制目前仍未完全清楚，很多研究表明機(jī)體免疫調(diào)節(jié)紊亂在HBV-ACLF的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞新亞群[3-4]，Th17細(xì)胞主要介導(dǎo)免疫炎癥[5]，Treg細(xì)胞主要介導(dǎo)免疫耐受，研究表明，它們?cè)诮閷?dǎo)炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病、腫瘤和移植排斥等的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[5-6]。本研究擬就HBV-ACLF患者外周血中Th17、Treg細(xì)胞頻率的變化及其與肝功能和HBV復(fù)制水平的關(guān)系進(jìn)行探討，進(jìn)一步了解HBV-ACLF的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取海南省農(nóng)墾總醫(yī)院2013年4月至2014年12月的門(mén)診、住院患者及健康體檢者共66例，其中，HBV-ACLF組患者22例；慢性乙型肝炎組(CHB組)患者24例；健康對(duì)照組(HC組)20例。診斷參照2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝臟病學(xué)分會(huì)制定的《慢性乙型肝炎防治指南》[7]和2006年中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)制定的《肝衰竭診療指南》[8]，同時(shí)排除合并其他類型病毒性肝炎、HIV感染、酒精性肝病、自身免疫性疾病、甲亢等，發(fā)病前均未行系統(tǒng)的抗病毒治療、免疫調(diào)節(jié)治療和人工肝治療。

1.2 主要試劑與儀器 改良型RPMI1640培養(yǎng)液(北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)，人淋巴細(xì)胞分離液和胎牛血清(北京索萊寶科技有限公司)，佛波酯(PMA)、離子霉素(Ion)、莫能霉素和Human Th17/ Treg Phenotyping Kit(BD Bioscience)，PBS緩沖液(Hyclone)。美國(guó)BD公司CANTO-Ⅱ流式細(xì)胞儀，美國(guó)ABIABI 5700實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 血清HBV-DNA、ALT、AST、TB的檢測(cè) 采用熒光定量PCR法檢測(cè)患者外周血HBV-DNA水平，采用速率法檢測(cè)血清ALT、AST(我院日立7600型全自動(dòng)生化分析儀)。

1.3.2 外周血Th17、Treg細(xì)胞的培養(yǎng)與檢測(cè) 取外周抗凝血300μl，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液900μl，加入佛波酯(PMA)及離子霉素1.2μl，莫能霉素0.8μl，充分混勻，置于溫度為37℃、濃度為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h后離心。依次加入固定破膜液BufferA(1 500μl)、Buffer C(500μl)，充分混勻后常溫避光保存時(shí)間分別為20 min和30 min，最后加入染色劑Phenotyping Cocktail(4μl)，用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)沖洗后上機(jī)檢測(cè)Th17、Treg細(xì)胞占CD4+T的頻率，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用中位數(shù)和百分位數(shù)(M±Q)表示，多個(gè)組之間的比較采用方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)和秩和檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)分析。以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組受檢者的年齡、肝功能、HBV-DNA水平比較 三組受檢者在性別構(gòu)成方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。平均年齡HBV-ACLF組高于CHB組，CHB組高于HC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，符合慢性HBV感染相關(guān)肝病的發(fā)展過(guò)程；肝功能指標(biāo)(ALT、AST、TB)HBV-ACLF組高于CHB組，CHB組高于HC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，符合相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。HBV-ACLF組和CHB組的HBV-DNA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 外周血Th17、Treg細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果 圖1、圖2顯示HBV-ACLF組中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞具有較大的熒光分布區(qū)；CHB組中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞具有一般大小的熒光分布區(qū)；HC組中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞具有較小的熒光分布區(qū)。對(duì)三組受檢者Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞、Th17/Treg行方差分析發(fā)現(xiàn)：HBV-ACLF組中Thl7細(xì)胞、Treg細(xì)胞、Th17/Treg較CHB組和HC組顯著升高；CHB組較HC組Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞、Th17/Treg升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

表1 三組受檢者年齡、肝功能、HBV-DNA水平比較(±s)

表1 三組受檢者年齡、肝功能、HBV-DNA水平比較(±s)

組別 性別 年齡(歲)ALT(U/L)AST(U/L)TB(μmol/L)HBV-DNA(lg copies/ml)女HBV-ACLF組(n=22) CHB組(n=24) HC組(n=20)檢驗(yàn)值P值男8 1 4 10 14 10 10 χ2=2.244 0.33 47.94±10.87 36.82±9.63 28.12±4.39 F=12.579 0.00 460.76±280.42 136.50±78.59 26.48±13.54 F=9.478 0.00 173.35±125.67 88.87±52.59 18.37±8.62 F=10.376 0.00 182.24±121.45 42.34±16.53 10.48±6.83 F=12.478 0.00 6.27±1.78 5.89±1.35 0 Z=-1.91 0.13

表2 三組受檢者外周血Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞、Th17/Treg檢驗(yàn)結(jié)果比較(±s，%)

表2 三組受檢者外周血Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞、Th17/Treg檢驗(yàn)結(jié)果比較(±s，%)

組別Th17/CD4+T Treg/CD4+T Th17/Treg HBV-ACLF組(n=22) CHB組(n=24) HC組(n=20)檢驗(yàn)值P值6.46±3.18 4.48±2.64 2.10±1.39 13.672 0.00 3.46±2.54 2.76±1.57 1.78±0.96 9.457 0.01 2.15±1.27 1.62±0.83 1.16±1.04 11.045 0.00

2.3 三組外周血Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞的相關(guān)性 對(duì)HBV-ACLF組、CHB組、HC組外周血中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞采用Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析，HBV-ACLF組Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞：r=0.873，P= 0.000＜0.05，存在正相關(guān)(見(jiàn)圖3)；CHB組Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞：r=0.638，P=0.02＜0.05，存在正相關(guān)(見(jiàn)圖4)；HC組Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞：r=0.617，P=0.000＜0.05，存在正相關(guān)(見(jiàn)圖5)。

2.4 兩組患者的Th17、Treg、Th17/Treg與肝功能(ALT、AST、TB)、HBV-DNA載量的相關(guān)性 通過(guò)Pearson相關(guān)檢驗(yàn)分析，HBV-ACLF組者外周血Th17細(xì)胞率與ALT(r=0.612，P=0.029)呈正相關(guān)關(guān)系(圖6)，Th17/ Treg與ALT(r=0.592，P=0.038)呈正相關(guān)關(guān)系(圖7)；CHB組外周血Th17細(xì)胞率與ALT(r=0.636，P=0.018)呈正相關(guān)關(guān)系(圖8)，Th17/Treg與ALT(r=0.712，P=0.008)呈正相關(guān)關(guān)系(圖9)。Treg細(xì)胞與肝功能均無(wú)相關(guān)性。

圖1 三組Thl7細(xì)胞的檢測(cè)

圖2 三組Treg細(xì)胞的檢測(cè)

圖3 ACLF組Th17與Treg相關(guān)性分析

圖4 CHB組Th17與Treg相關(guān)性分析

圖5 HC組Th17與Treg相關(guān)性分析

圖6 ACLF組Th17與ALT相關(guān)性

圖7 ACLF組Th17/Treg與ALT相關(guān)性

圖8 CHB組Th17與ALT相關(guān)性

圖9 CHB組Th17/Treg與ALT相關(guān)性

2.5 兩組患者的Th17、Treg、Th17/Treg與HBV-DNA的相關(guān)性 HBV-ACLF組患者和CHB組患者Th17、Treg、Th17/Treg與HBV-DNA間均無(wú)相關(guān)關(guān)系，見(jiàn)表3。

組別HBV-ACLF組(n=22) Th17/Treg r=0.252 P=0.254 r=0.349 P=0.455 CHB組(n=24) Th17/CD4+T r=0.012 P=0.098 r=0.463 P=0.152 Treg/CD4+T r=0.038 P=0.231 r=0.083 P=0.237注：r為相關(guān)系數(shù)。

3 討論

HBV-ACLF是HBV感染者在某種誘因下(如飲酒、勞累、藥物等)導(dǎo)致的肝細(xì)胞大量壞死而出現(xiàn)的以肝功能?chē)?yán)重受損為特征的綜合征。肝衰竭的發(fā)生是病毒、宿主和環(huán)境相互作用的結(jié)果，其中，病毒誘發(fā)的機(jī)體免疫損傷在肝衰竭的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[9-10]。Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新的不同于Th1、Th2的CD4+T細(xì)胞新亞群，Th17細(xì)胞可以通過(guò)分泌IL-17A、IL-17F、IL-22、IL-8、單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)、GM-CSF等相關(guān)炎癥因子、趨化因子和集落刺激因子的生成，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞遷移到病灶，促進(jìn)免疫反應(yīng)[11-12]；Treg細(xì)胞可以分泌TGF-β、IL-4、IL-10、等細(xì)胞因子，通過(guò)直接接觸或分泌免疫因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[13-14]。本研究中HBV-ACLF組、CHB組Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞均存在正相關(guān)，且HBV-ACLF組和CHB組中Th17/Treg較HC組高，說(shuō)明正常情況下Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞在體內(nèi)處于一種平衡，在HBV-ACLF和CHB中這種平衡被打破。

本研究中HBV-ACLF患者外周血中Th17、Treg細(xì)胞的頻率高于CHB組和HC組，Th17/Treg比率也明顯升高，且Th17細(xì)胞、Th17/Treg與血清中ALT呈正相關(guān)。這說(shuō)明在HBV-ACLF患者體內(nèi)，Th17、Treg細(xì)胞都有所增加，但以Th17細(xì)胞的增加更顯著，活化后的Th17細(xì)胞能募集各種炎性細(xì)胞增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)，但是過(guò)強(qiáng)的免疫反應(yīng)有致肝細(xì)胞損傷的作用；同時(shí)，Treg細(xì)胞的增加能避免過(guò)強(qiáng)的免疫反應(yīng)造成肝細(xì)胞的大量壞死[15]，所以Treg細(xì)胞的增加可能是機(jī)體因適應(yīng)性的需要而產(chǎn)生的一種反饋調(diào)節(jié)。Th17細(xì)胞、Th17/Treg與血清中ALT呈正相關(guān)，且它們?cè)贖BV-ACLF組、CHB組、HC組依次降低，說(shuō)明Th17可能是導(dǎo)致HBV相關(guān)肝病重癥化的一個(gè)因素，這與國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果基本符合[16-18]，初步表明Th17介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能參與HBV-ACLF疾病的發(fā)展。Zhang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，Th17加重肝損傷的同時(shí)，也有清除乙型肝炎病毒(HBV)的作用；Yang等[20]的研究結(jié)果認(rèn)為T(mén)reg細(xì)胞與HBV-DNA呈正相關(guān)。本研究中CHB組和HBV-ACLF患者組Th17、Treg、Th17/Treg與 HBV DNA間無(wú)相關(guān)性，與他們的結(jié)果不一致。說(shuō)明Th17、Treg細(xì)胞并不能直接影響HBV-DNA的復(fù)制，HBV-ACLF患者中Th17、Treg細(xì)胞的分化、成熟是否受HBV或其他免疫細(xì)胞的影響，目前仍無(wú)定論，具體機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

筆者通過(guò)在用藥和系統(tǒng)治療前觀察HBV-ACLF患者外周血中Th17、Treg細(xì)胞的變化及其與肝功能和HBV-DNA間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Th17和Treg細(xì)胞與HBV-ACLF的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其在外周血中的變化可以協(xié)助判斷機(jī)體的免疫狀態(tài)，有望成為判斷肝損傷患者嚴(yán)重程度的一個(gè)免疫標(biāo)志。下一步的研究應(yīng)該在用藥或系統(tǒng)治療后的不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)一步觀察Th17、Treg細(xì)胞的變化及其與肝功能和HBV-DNA間的關(guān)系，這有利于進(jìn)一步闡明HBV-ACLF的發(fā)病機(jī)制，也對(duì)制訂治療方案、判斷療效有重要的指導(dǎo)意義。

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Change of Th17 cell,Treg cell in patients with HBV-associated acute-on-chronic liver failure and its relationship with liver function and HBV-DNA load.

Shen Min1,LIN Ming-qiang1,FENG Qi-tao1,LV You-kai1,LI Yong-wu2.Department of Infectious Diseases1,Laboratory of Molecular Biology2,Hainan Provincial Nongken General Hospital,Haikou 570311,Hainan,CHINA

ObjectiveTo detect the levels of Th7 and Treg cells in patients with hepatitis B virus-associated acute-on-chronic liver failure(HBV-ACLF)and to analyze the effect of Th7 and Treg cells in the pathogenesis of HBV-ACLF.MethodsThe frequency of Th17 and Treg cells in peripheral blood of 22 patients with HBV-ACLF (HBV-ACLF group),24 patients with chronic hepatitis B(CHB group)and 20 healthy controls(HC group)were determined by flowcytometry.HBV-DNA loads were measured by fluorescent PCR.Finally,the correlations among Th17, Treg,Th17/Treg,alanine aminotransferase(ALT),aspertate aminotransferase(AST),total bilirubin(TB)and HBV-DNA loads were analyzed.ResultsThe levels of Th17,Treg and Th17/Treg in HBV-ACLF group were significantly higher than those in CHB group and HC group,and the levels in CHB group were significantly higher than those in HC group (P＜0.05).Th17 was positively correlated with Treg in HBV-ACLF group,CHB group,and HC group(P＜0.05),with the correlation coefficients of 0.873,0.638,0.617,respectively.Th17 was positively correlated with ALT in HBV-ACLF group and CHB group(r=0.612,P＜0.05;r=0.636,P＜0.05),and Th17/Treg was positively correlated with ALT in HBV-ACLF group and CHB group(r=0.592,P＜0.05;r=0.712,P＜0.05).Th17,Treg,Th17/Treg showed no correlation with HBV DNA load in HBV-ACLF group and CHB group,and also with AST and TB in the three groups(P＞0.05).ConclusionTh17 and Treg may be in a balanced state in healthy people,and such state might be broken in patients with CHB and HBV-ACLF,which indicates that Th17 and Treg are involved in the occurrence and development of CHB and HBV-AVLF.Th17 cell could be used as an immunological marker for determination of the liver damage degree in HBV-ACLF.Th17,Treg have no correlation with the load of HBV-DNA.

Th17;Treg;Hepatitis B virus(HBV);Acute-on-chronic liver failure(ACLF);Alanine aminotransferase(ALT);Aspartate aminotransferase(AST)

R512.6+2

A

1003—6350（2016）05—0692—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.05.004

2015-06-10)

沈敏。E-mail：531635658@qq.com