兩種海洋寡糖對仿刺參免疫活性的影響

劉美思，程立坤，羅 希，許青松，王秀武，尹 恒

（1.遼寧師范大學生命科學學院，大連 116021；2.中國科學院大連化學物理研究所天然產物及糖工程研究組，大連 116011）

兩種海洋寡糖對仿刺參免疫活性的影響

劉美思1，2，程立坤2，羅 希2，許青松2，王秀武1，尹 恒2

（1.遼寧師范大學生命科學學院，大連 116021；2.中國科學院大連化學物理研究所天然產物及糖工程研究組，大連 116011）

研究了褐藻酸鈉寡糖（AOS）和殼寡糖（COS）對仿刺參（Apostichopus japonicus）生長及免疫功能的影響。實驗分為對照組、COS組和AOS組，對照組投喂企業常規飼料，COS組在對照組飼料基礎上添加殼寡糖（1 g·kg－1），AOS組在對照組飼料基礎上添加褐藻酸鈉寡糖（1 g·kg－1）。在第30、60、90天，測定各組仿刺參的質量，并在第90天隨機采集50 ind仿刺參的體腔液，測定酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、過氧化氫酶和一氧化氮合酶等免疫酶的活力。結果表明，AOS組和COS組仿刺參體質量分別比對照組增長16.4%和18.2%；AOS組仿刺參的酸性、堿性磷酸酶活性分別提高了75.1%和67.3%；而COS組仿刺參的過氧化氫酶和一氧化氮合酶的活性分別提高了190.3%和55.6%。海洋寡糖COS和AOS作為仿刺參的免疫增強劑，可有效提高幼參的生長性能和免疫力，其中COS的作用效果優于AOS。

仿刺參；免疫增強劑；殼寡糖；褐藻酸鈉寡糖

仿刺參（Apostichopus japonicus）是海參綱中營養價值和藥用價值最高的種類［1－2］。近年來，隨著人們對其營養保健功能認同度的上升，我國北方仿刺參養殖業迅速發展。遼寧仿刺參產量占全國仿刺參總產量的近40%，產值超過100億元。但仿刺參養殖環境卻與日俱下，病害頻發［3］，養殖中抗生素使用過量，因此通過免疫調控減少抗生素的使用具有重大意義［4］。免疫增強劑是一類通過不同作用方式提高機體免疫功能的物質，可單獨或協同與抗原使用，增強機體的免疫應答［5］。功能性寡糖作為一類新型的免疫增強劑在畜禽養殖中已經被大量應用，而在水產養殖中的應用是近年來的研究熱點［6］。

褐藻酸鈉寡糖（AOS）是海藻酸鈉降解而成的一種寡聚物，由甘露糖醛酸（M）、古羅糖醛酸（G）或二者雜合段組成，為酸性寡糖［7］；殼寡糖（COS）是D－氨基葡萄糖的寡聚體，為幾丁質或殼聚糖經化學法、酶法等水解的天然產物，屬于堿性寡糖［8］；二者均為功能性寡糖。研究表明，COS可以顯著增加凡納濱對蝦（Litopenaeusvannamei）血清中高密度脂蛋白膽固醇的含量，從而促進脂類代謝［9］；此外，添加稀土金屬和COS的復合物可以提高大菱鲆（Scophthalmus maximus）的先天免疫及抵抗力［10］；還有研究指出，AOS對點帶石斑魚（Epinephelus coicoides）的非特異性免疫應答有提高作用［11］。本實驗研究了海洋寡糖AOS和COS對仿刺參幼參生長以及相關免疫指標的影響，以期為寡糖免疫增強劑在水產養殖中應用的研究積累基礎數據和提供參考。

1 材料與方法

1.1 AOS和COS的制備

實驗用COS和AOS系本實驗室利用酶解技術制備，聚合度分別為2－8和2－10的寡糖［12－13］。

1.2 實驗動物分組和飼養

所用仿刺參購自仿刺參育苗生產企業，實驗用仿刺參幼參平均體質量6.7×10－3g，平均體長3.3 mm，將投喂不同飼料的3個組按0.425 kg/池的密度分別飼養在20 m3/池的水池中（水溫20.2℃～20.4℃、室內溫度15℃～22℃、鹽度30～33，充氧氣）：對照組投喂正常飼料（大葉菜91.1%、大麥0.8%、大豆肽0.8%、蠣殼粉1.8%、酵母粉2.3%、海虹粉1.4%、扇貝裙邊1.8%）；COS組投喂正常飼料中添加COS的飼料，添加量為1 g·kg－1飼料；AOS組投喂正常飼料中添加AOS的飼料，添加量為1 g·kg－1飼料。養殖實驗的管理方法按照仿刺參育苗企業管理規范，每天早晚各投喂一次，飽食投喂，每兩周換水一次。實驗期90 d，分為3個階段，每個階段30 d。

1.3 生長和免疫的指標測定

每個實驗階段結束時，分別測定各組仿刺參的體質量，整個實驗結束時在每組隨機取50 ind仿刺參，解剖取其體腔液，平均混合成10個樣本，按照1∶1體積比加入抗凝劑，干冰保存運回實驗室，4℃3 000 r·min－1離心10 min，取上清液，－80℃冰箱儲存。

參考南京建成生物研究所試劑盒說明書測定仿刺參體腔液中一氧化氮合酶（NOS）、過氧化氫酶（CAT）、溶菌酶（LSZ）、酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）的活性。

1.4 數據處理

所有實驗數據均以“平均值±標準差”表示。用統計軟件SPSS 17.0進行方差分析，差異顯著時對平均值進行Duncan’s多重比較。

2 結果與分析

2.1 AOS和COS的聚合度分布表征

利用酶解技術降解海藻酸鈉獲得了AOS，聚合度在2－10，平均分子量＜2 kDa，利用時間飛行質譜對AOS聚合度分布進行表征（圖1-A）；通過殼聚糖酶解技術制備的COS聚合度在2-8，脫乙酰度＞95%，平均分子量＜1 kDa，利用時間飛行質譜對COS聚合度分布進行表征（圖1-B）。

2.2 AOS、COS對仿刺參生長的影響

實驗第30、60、90天仿刺參體質量變化見表1。第30天時，COS組的仿刺參體質量為1.5 kg，比對照組（體質量為1.1 kg）高36.4%；而AOS組為1.0 kg，比對照組減少9.1%。第60天時，COS組為4.5 kg，比對照組（3.8 kg）高18.4%；AOS組為4.6 kg，比對照組增加21.1%。在第90天時，COS組為6.5 kg，比對照組（5.5 kg）增加18.2%；AOS組體質量為6.4 kg，比對照組增加了16.4%。整體上看，殼寡糖對仿刺參的增重效果比褐藻酸鈉寡糖好，尤其是在幼參初期階段，但到幼參中后期，兩種寡糖的增重效果基本相當。

2.3 AOS、COS對仿刺參堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性的影響

實驗結果表明，AOS組和COS組仿刺參體腔液中堿性磷酸酶活性分別比對照組顯著增高67.3%和60.2%（P＜0.05）（圖2），酸性磷酸酶活性分別增高75.1%和50.2%（P＜0.05）（圖3）。

2.4 AOS、COS對仿刺參NOS、CAT和LSZ活性的影響

與對照組相比，NOS活性AOS組和COS組分別提高15.2%和55.6%（圖4），CAT活性AOS組和COS組分別提高80.0%（P＜0.05）和190.3%（P＜0.05）（圖5），LSZ活性AOS組（22.3%）和COS組（38.4%）也均有提高（圖6）。

圖1 AOS、COS的ESI－MS圖（A.褐藻酸寡糖質譜圖，B.殼寡糖質譜圖）Fig.1 ESI－MS images of AOS and COS（A.AOS，B.COS）

表1 褐藻酸鈉寡糖和殼寡糖對仿刺參體質量的影響Tab.1 Effect of AOS and COS on the weight of sea cucumber

圖2 AOS、COS對仿刺參AKP活力的影響Fig.2 Effect of AOS and COS on AKP activity in sea cucumber

圖3 AOS、COS對仿刺參ACP活力的影響Fig.3 Effect of AOS and COS on ACP activity in sea cucumber

圖4 AOS、COS對仿刺參總NOS活力的影響Fig.4 Effect of AOS and COS on NOS activity in sea cucumber

圖5 AOS、COS對仿刺參CAT活力的影響Fig.5 Effect of AOS and COS on CAT activity in sea cucumber

圖6 AOS、COS對仿刺參LSZ活力的影響Fig.6 Effect of AOS and COS on LSZ activity in sea cucumber

3 討論

資源豐富的海洋生物多糖具有特殊的化學結構，如獨特的活性基團，使其表現出一定的生理活性［14－15］，如調節免疫、抗腫瘤、抗氧化等。如珍珠貝多糖肽可以增強合浦珠母貝（Pinctada fucata）非特異性免疫能力［16］。而以海洋生物多糖為原料，通過酶解途徑制備出的寡糖表現出比多糖更強的生理活性。研究表明，海洋寡糖具有調節免疫、抗腫瘤、抗氧化等多種生理活性。在水產養殖中，已有研究證實，寡糖可提升魚類免疫力，增強其抗病的能力，如孫立威等［17］研究指出飼料中添加COS能顯著提高吉富羅非魚（Oreochromis niloticus）幼魚的增重率。而本研究結果顯示，AOS和COS能增加仿刺參的增重率；同時，COS亦能顯著增強幼魚血清中AKP、LSZ和SOD活性，提高機體的非特異性免疫。

仿刺參的非特異性免疫系統對于仿刺參抵抗外來病原菌攻擊具有重要的作用。ACP、AKP是溶酶體酶的重要組成部分，對仿刺參免疫反應、抵御疾病和細胞修復具有重要意義［18］。本實驗結果顯示，兩種寡糖均可顯著提高仿刺參的ACP和AKP活力，AOS的作用效果略優于COS，推測兩種寡糖通過提高ACP、AKP活力來提高仿刺參的免疫能力。NOS是生物體非特異性免疫系統的重要組成部分，可以在病原體、細胞因子、免疫刺激物等的作用下殺滅病原生物。從實驗結果來看，COS對仿刺參幼參體腔液中NOS活性的提升效果優于AOS，兩種寡糖都優于對照組，推測兩種寡糖通過提高NOS的活性來提升仿刺參的免疫力。CAT的主要作用是催化H2O2分解為H2O與O2，使H2O2不與O2在鐵螯合物的作用下發生反應生成有害的－OH。結果顯示，與對照組相比，兩種寡糖均可提高仿刺參幼參體腔液中CAT活性，COS作用效果優于AOS，推測提高CAT活性也是兩種寡糖提高仿刺參幼參免疫的一個途徑。

本研究發現AOS和COS可作為仿刺參幼參飼料的寡糖免疫增強劑，改善其生長，提升體腔液中CAT和NOS等免疫酶的活性以增強幼參的免疫力。研究結果有利于研發適用于不同階段仿刺參育苗的寡糖免疫增強劑，提高仿刺參育苗的成活率和增重率，減少抗生素和化學藥品的用量。

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Influnce of two marine oligosaccharides on the immune activity of juvenile sea cucumber

LIU Mei-si1，2，CHENG Li-kun2，LUO Xi2，XU Qing-song2，WANG Xiu-wu1，YIN Heng2
（1.School of Life Science，Liaoning Normal University，Dalian116021，China；2.Natrual Products and Glyco-Biotechnology，Dalian Institute of Chemical Physics，Chinese Academy of Sciences，Dalian116011，China）

Apostichopus japonicusis a valuable specieswith nutritional and medicinal value in Holothuroidea.In recent years，sea cucumber business in North China has been growing fast.The production of sea cucumber in North China is about40%of the total domestic production，and the output value ismore than ten billion RMB.However，the frequent occurrence of sea cucumber disease leads to the abuse of antibiotics.It is significant to decrease the use of antibiotics.The functional oligosaccharides，as a new immunopotentiator，have been applied in the breeding of livestock and poultry.And its application in the breeding ofmarine lives has been a hot spot in recent years.The paper investigated the influence of alginate oligosaccharides and chitosan oligosaccharides during sea cucumber breeding to increase the production，improve the disease resistance of sea cucumbers effectively and to reduce the amountof antibiotic during the breeding process.The test cycle was 90 days，and three groups，control check，alginate oligosaccharides and chitosan oligosaccharideswere investigated.Control check was fed according to the average feed standard.Chitosan oligosaccharide and alginate oligosaccharide groups were fed with chitosan oligosaccharides and alginate oligosaccharides（1 g·kg－1）respectively in addition to the average feed standard.The juvenile sea cucumber（0.425 kg per pond）was fed in 20 m3pond respectively.Each group wasweighed after 30 days，60 days and 90 days and the coelomic fluid of 50 randomly selected sea cucumbers in each group were gathered after 90 days and their immune enzyme activities，acid phosphatase，alkaline phosphatase，catalase，nitricoxide synthase were tested.Results showed that alginate oligosaccharide and chitosan oligosaccharide increased the sea cucumber growth rate by 16.4%and 18.2%respectively.Alginate oligosaccharide increased the acid phosphatase activity by 75.1%and the alkaline phosphatase activity by 67.3%.The chitosan oligosaccharide increased the catalase activity by 190.3%and the nitric oxide synthase activity by 55.6%.Therefore，as a kind of immunopotentiator，chitosan oligosaccharide and alginate oligosaccharide can effectively improve the juvenile sea cucumber production and immunity，and the effect of chitosan oligosaccharide is superior to that of alginate oligosaccharide.To conclude，the addition of alginate oligosaccharide and chitosan oligosaccharide as immunopotentiator is beneficial for the increase of survival rate and weight gain rate of juvenile sea cucumber，improving the immunity and disease resistance of sea cucumbers，decreasing the usage of antibiotics and other chemicals during the seedling stage.

sea cucumber；immunopotentiator；chitosan oligosaccharides；alginate oligosaccharides.

S 963.3

A

1004－2490（2016）01－0051－06

2015－07－03

國家海洋公益性行業科研專項“新型海水養殖疾病防治綠色系列產品研發及其產業化應用”（項目編號201405003）；國家科技支撐項目“大型海藻新型產品加工技術”（項目編號2013BAB01B01）；大連市科技興海專項“安全健康刺參育苗新模式構建”（項目編號20140101）；中科院青年創新促進會（項目編號2015144）

劉美思（1991－），女，遼寧綏中人，碩士研究生，研究方向：動物營養與生理。

尹 恒，男，研究員，Tel：0411－84379061，E-mail：yinheng＠dicp.ac.cn；王秀武，男，教授，

Tel：13478991092，E-mail：wxw5632＠163.com