翼繭形藻培養基的篩選及優化

宋邦興，王 珺，2，3，陳國華，2，楊金華，許炳亮

（1.海南大學海洋學院，海口 570228；2.熱帶生物資源教育部重點實驗室，海南大學，海口 570228；3.海南大學海洋生物實驗教學中心，海口 570228）

翼繭形藻培養基的篩選及優化

宋邦興1，王 珺1，2，3，陳國華1，2，楊金華1，許炳亮1

（1.海南大學海洋學院，海口 570228；2.熱帶生物資源教育部重點實驗室，海南大學，海口 570228；3.海南大學海洋生物實驗教學中心，海口 570228）

在“寧波大學3＃培養液”配方的基礎上，通過單因子和正交試驗，研究了氮、磷、鐵、硅、維生素B1和B12等主要營養元素對翼繭形藻（Amphiprora alata）生長繁殖的影響。獲得了以天然海水為基礎的翼繭形藻優化培養基：40 mg·L－1NaNO3-N、8 mg·L－1KH2PO4-P、0.5 mg·L－1FeSO4-Fe、20 mg·L－1Na2SiO3-Si、0.1 mg·L－1Vitamin B1和0.05 mg·L－1Vitamin B12。用優化培養基與“寧波大學3＃培養液”對比培養翼繭形藻，結果表明，培養第2～7天，優化培養基比“寧波大學3＃培養液”收獲翼繭形藻的生物量（細胞密度）每天分別提高了1.45、1.83、2.12、2.26、2.32和2.40倍。

翼繭形藻；培養基；優化；生長

翼繭形藻（Amphiprora alata）是一種褐色的海洋底棲硅藻，屬羽紋硅藻綱（Pennnatae），有殼縫硅藻目（Raphidinales），舟形藻科（Naviculaceae kützing），繭形藻屬。有關繭形藻的研究很少，JUAN等［1］研究了8種底棲硅藻為餌料，分析不同餌料對紅鮑魚（Haliotis rufescens）后期幼體生長的影響，結果發現同時投喂繭形藻（Amphiprorasp.）和菱形藻（Nitzschiasp.）的紅鮑魚后期幼體生長最快。胡蓓娟等［2］研究了8種微藻的保存方法，提出繭形藻較適合弱光低溫保存，同時指出無論是其生態分類、生長優化還是大分子化合物的提取都鮮有相關研究性報道，這種藻類更具有研究的潛力。由于翼繭形藻含有豐富的蛋白質、脂肪酸等營養物質，是水產動物苗種的優良餌料。為了更好地研究利用翼繭形藻，首先要獲得大量的藻體，因而如何實現高密度規模培養是生產性應用關鍵，合適的培養基是實現翼繭形藻高密度培養的重要因素。王珺等［3］曾研究了翼繭形藻的培養條件，得出培養該藻最佳的生態因子（溫度、光照、鹽度和pH值）。本文研究了不同種類及濃度的氮、磷、鐵、硅、維生素B1及B12等主要營養元素對翼繭形藻生長繁殖的影響，優化翼繭形藻的培養基配方，以期為翼繭形藻的大規模培養提供基礎性資料。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

翼繭形藻取自海南大學海洋學院藻種室。該硅藻取自海南省文昌市翁田鎮海區，經微吸管分離、純化得到的新藻株。藻體單個生活，殼環面雙凹的橢圓形，長60～160μm，寬36～60μm。中央凹縊處寬度26～38μm；殼面棱形，兩端漸大，至頂端圓鈍，色素體大，1個，呈板狀［4］。實驗前接種到1 000 mL三角燒瓶中進行活化純培養，不充氣，每天搖動2～3次，取指數生長期的藻液進行實驗。

1.2 方法

1.2.1 藻體培養條件

培養用的海水取自海口白沙門海區，經黑暗沉淀，再經脫脂棉過濾、煮沸、自然冷卻后使用。海水pH 8.03，鹽度30。實驗培養瓶選用250 mL齒輪牌三角瓶，經洗液洗滌、晾干，130℃恒溫消毒2 h。除溫度實驗外，其余試驗組溫度控制在（26±1）℃，光照強度3 000 lx，光周期為全天日光燈照明，培養時間為4～5 d。每天搖瓶3次，并隨機交換位置，以減少照度差異。

本實驗的培養液均采用添加10 mg·L－1Na2SiO3的“寧波大學3＃培養液”配方［5］。

1.2.2 實驗設計

1.2.2.1 單因子實驗

根據“寧波大學3＃培養液”配方，分別配制缺氮、缺磷、缺鐵、缺硅培養液。氮源種類及質量濃度的篩選：分別以硫酸銨［（NH4）2SO4］、硝酸鈉（NaNO3）、尿素（NH2CONH2）為營養鹽，其氮的質量濃度梯度分別為0、10、20、30、40、50、60 mg· L－1；磷源種類及質量濃度的篩選：分別以磷酸二氫鉀（KH2PO4）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）為營養鹽，磷的質量濃度梯度分別為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mg·L－1；鐵源種類及質量濃度的篩選：以硫酸亞鐵（FeSO4）及檸檬酸鐵（C6H5O7Fe）為鐵鹽，設置鐵質量濃度梯度為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mg·L－1；硅鹽質量濃度的篩選：以硅酸鈉（Na2SiO3）為營養鹽，設置硅質量濃度梯度為0、5、10、15、20、25、30 mg· L－1。各實驗均設置2個水平實驗。

1.2.2.2 維生素B1和B12正交實驗

針對微藻對維生素B1（VB1）和維生素B12（VB12）的需求，分別以4個濃度梯度水平，選用L16（42）設計2因子4水平的正交實驗（表1）。

表1 正交實驗因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiments（mg·L－1）

1.2.2.3 培養基對比實驗

選取單因子實驗中翼繭形藻生長繁殖最優的氮、磷、鐵、硅等營養鹽種類及質量濃度和正交實驗中VB1和VB12的最佳配比，作為優化后的培養液配方；對照組培養液采用添加10 mg·L－1Na2SiO3的“寧波大學3＃培養液”配方，接種密度及培養條件一致，每天定時計數，共培養7 d，各實驗均設計2個水平。

1.2.3 藻細胞計數

先做藻細胞密度與藻液光密度OD值（A420，不加藻種培養液為空白）的相關曲線。將實驗用藻液稀釋成5個相關濃度梯度，分別用722S可見分光光度計在420 nm處測定濃度組OD值，并用XB-K-25血球計數板分別計數藻細胞密度（甲醛固定，1 d完成計數，每瓶重復計數2次，取平均值），確定藻細胞密度與藻液OD值的線性關系；測定實驗藻液的吸光值，根據藻細胞密度與OD值的線性關系換算出藻細胞密度。

1.2.4 比生長速率

藻細胞的比生長速率（K）由公式計算：

式中，N0：起始藻細胞密度；Nt：經過T時間培養后的藻細胞密度；T：培養時間（d）。

1.2.5 統計分析

運用Excel軟件進行數據處理，并使用DPS數據處理系統進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 單因子實驗

2.1.1 氮

氮的單因子實驗結果見圖1，從圖1可知，硝酸鈉、硫酸銨和尿素均可作為氮源，最適合翼繭形藻生長的氮鹽為硝酸鈉，以40 mg·L－1的質量濃度為最佳。經單因素方差分析得知，3種氮鹽對翼繭形藻生長的影響均極顯著（P＜0.01）。

2.1.2 磷

磷的單因子實驗結果見圖2，由圖2可知，磷酸二氫鈉和磷酸二氫鉀均可做為翼繭形藻的磷鹽，最適合生長的磷濃度為8～9 mg·L－1。經方差分析，不同濃度的磷鹽對翼繭形藻的生長影響存在極顯著差異（P＜0.01）。

圖1 氮鹽及其濃度對翼繭形藻生長的影響Fig.1 Effects of different N concentrations on the grow th of Amphiprora alata

圖2 磷鹽及其濃度對翼繭形藻生長的影響Fig.2 Effects of different P concentrations on the grow th of Amphiprora alata

2.1.3 鐵

鐵的單因子實驗結果見圖3，由圖3可知，硫酸亞鐵和檸檬酸鐵均可作為翼繭形藻的鐵鹽，最佳的鐵濃度為0.5～0.6 mg·L－1，當鐵濃度大于0.6 mg·L－1時，抑制翼繭形藻的生長。經單因素方差分析得知，鐵鹽對翼繭形藻的生長有顯著影響（P＜0.05）。

2.1.4 硅

硅的單因子實驗結果見圖4，從圖4可知，在Na2SiO3-Si的質量濃度為5～30 mg·L－1的范圍內均可促進翼繭形藻的生長，其最適生長的質量濃度范圍為10～25 mg·L－1，經單因素方差分析得知，Na2SiO3對翼繭形藻生長的影響極顯著（P＜0.01）。

2.2 維生素B1和B12正交實驗

正交實驗結果見表2，從表2可知，3號組合培養翼繭形藻的效果最好，即VB1和VB12最佳的質量濃度分別為0.100、0.050 mg·L－1。對實驗結果進行方差分析（表3），由表3可知，維生素B1、B12單獨使用對翼繭形藻的生長無顯著影響，而維生素B1、B12混合作用對翼繭形藻生長有極顯著影響（P＜0.01）。

圖3 鐵鹽及其濃度對翼繭形藻生長的影響Fig.3 Effects of different Fe concentrations on the grow th of Amphiprora alata

圖4 硅濃度對翼繭形藻生長的影響Fig.4 Effects of different Si concentrations on the grow th of Am phiprora alata

表2 維生素的正交實驗結果Tab.2 Orthogonal experimental results of vitam ins

表3 正交實驗方差分析結果Tab.3 Variance analysis of orthogonal experim ent

2.3 優化培養基的驗證

為了驗證優化培養基的效果，將優化培養基與“寧波大學3＃培養液”進行了對比培養實驗，每天定時測定藻細胞密度，共培養7天，設置2個平行組，取平均值。培養結果見圖5。由圖5可知，接種第1天，翼繭形藻在2種培養基中的生長速率差別不大，優化培養基稍微優于“寧波大學3＃培養液”，而從第2天開始至第7天，優化培養基的藻細胞密度每天分別為“寧波大學3＃培養液”的1.45、1.83、2.12、2.26、2.32、2.40倍，可見優化培養基的培養效果極顯著優于“寧波大學3＃培養液”配方（P＜0.01）。

3 討論

不同種類的微藻，對營養鹽的需求不一樣，即每一種微藻都有適合各自生長繁殖的培養基，培養基中營養鹽的種類和濃度影響著微藻的生長率、營養成分及終產量，因此，選擇合適的培養基是獲得最佳培養效果的前提條件。本實驗以常用的“寧波大學3＃培養液”配方為基礎，通過單因子及正交實驗，對翼繭形藻培養基進行了優化，得到了優化培養基。

3.1 氮鹽

氮被稱為生命的元素，在植物體中，氮是蛋白質、核酸、磷脂的主要成分，而這三者又是原生質、細胞核和生物膜的重要組成部分，它們在生命活動中有著特殊作用［6］。通常認為，氮和磷是淡水和海洋生態系統中限制藻類生長的最普通的營養鹽［7－8］。已有實驗表明，不同種類的單細胞藻能利用不同種類的氮源，對氮鹽的質量濃度要求也不一樣［9］。本實驗結果表明，硝酸鈉、尿素、硫酸銨均能被翼繭形藻利用。在實驗設置的質量濃度范圍內，NaNO3-N最佳的質量濃度為40 mg·L－1，質量濃度范圍在10～40 mg·L－1時，翼繭形藻的K值隨著氮鹽質量濃度的升高而升高，質量濃度范圍在40～60 mg·L－1時，翼繭形藻的K值隨著氮鹽質量濃度的升高而降低；NH2CONH2-N最佳的質量濃度為40 mg·L－1，質量濃度范圍在0～40 mg·L－1時，翼繭形藻的K值隨著氮鹽質量濃度的升高而升高，而質量濃度范圍在40～60 mg·L－1時，翼繭形藻的生長速率隨著氮質量濃度的升高而降低；（NH4）2SO4-N的最佳質量濃度為20 mg·L－1，質量濃度范圍在0～20 mg·L－1時，翼繭形藻的K值隨著氮鹽質量濃度的升高而升高，而質量濃度范圍在20～60 mg·L－1時，翼繭形藻的K值隨著氨氮質量濃度的升高而降低，這是由于在單細胞藻類的培養過程中，CO2被藻類吸收而導致培養液的pH值升高，從而使NH4＋易變為NH3，并使藻類受到毒害的緣故。有研究表明，直鏈藻（Melosioasp.）最佳氮鹽質量濃度為20～40 mg·L－1［10］；小環藻（Cyclotella caspiaunder）最佳的氮鹽質量濃度為30 mg·L－1［11］；日本星桿藻（Asterionella japonica）最佳的（NH2）2CO-N質量濃度為20 mg ·L－1［12］。可見，翼繭形藻對氮元素的需求量相對較大。

3.2 磷鹽

磷元素是藻類葉綠體雙層膜、DNA與ATP的構成成分，它在光合作用的物質轉化中起著重要的作用，是藻類營養中僅次于氮的元素。實驗結果表明，磷是翼繭形藻的一個重要因子，2種不同磷鹽對翼繭形藻生長繁殖的影響差異不大，其中KH2PO4-P的最佳質量濃度為8 mg·L－1，NaH2PO4-P以9 mg·L－1為最佳。KH2PO4在P濃度范圍為1～8 mg·L－1時隨著P濃度增高，K值逐漸增大，而在P濃度范圍為8～10 mg·L－1時，隨著其質量濃度增加，K值逐漸減小；NaH2PO4-P在P濃度范圍為1～9 mg·L－1時隨著濃度增高，K值逐漸增大，而在P濃度范圍為9～10 mg·L－1時，隨著其質量濃度的增加，該藻的K值越來越小，說明高質量濃度的磷鹽對翼繭形藻的生長有抑制作用。有研究表明，直鏈藻最佳的KH2PO4-P濃度為1 mg·L－1［10］；小環藻最佳的KH2PO4-P濃度為1 mg·L－1［11］；日本星桿藻最佳的NaH2PO4-P濃度為0.5 mg·L－1［12］；牟氏角毛藻（Cheatocerosmuelleri）最佳KH2PO-P濃度為3 mg·L－1［13］。可見，翼繭形藻對磷元素的需求量相對較大。

圖5 翼繭形藻在不同培養基中的生長速率比較Fig.5 Grow th rates of Amphiprora alata in differentmedia

3.3 鐵鹽

鐵是藻類細胞內某些氧化－還原的載體和輔酶的組成成分，缺鐵會影響多種代謝過程，甚至會抑制藻細胞的生長［14］。實驗結果表明，加鐵試驗組的K值明顯比對照組的K值大，這說明鐵是翼繭形藻生長繁殖的重要微量元素。其中FeSO4的效果稍優于FeC6H5O7。FeSO4-Fe質量濃度范圍在0～0.5 mg·L－1時，隨著其質量濃度的增加K值呈上升趨勢，以質量濃度0.5 mg· L－1為最佳；FeC6H5O7-Fe質量濃度范圍在0～0.6 mg·L－1時，隨著其質量濃度的增加K值呈上升趨勢，以質量濃度0.6 mg·L－1為最佳，當濃度大于0.7 mg·L－1時，抑制翼繭形藻的生長。有研究表明，小環藻最佳的鐵鹽質量濃度為0.1 mg·L－1［11］；牟氏角毛藻最佳鐵鹽質量濃度為1 mg·L－1［13］；四爿藻（Tetraselmis chui）最佳的鐵鹽質量濃度為0.4 mg·L－1［15］。

3.4 硅鹽

硅是硅藻生長繁殖的必需營養元素，它除了作為細胞壁結構成分外，還參與蛋白質、光合色素、DNA合成及細胞分裂等多種代謝和生長過程［16］。實驗結果表明，加硅試驗組藻細胞K值均顯著大于缺硅對照組的藻細胞K值，翼繭形藻在Na2SiO3-Si質量濃度為0～30 mg·L－1的范圍內均能生長繁殖，質量濃度在0～5 mg·L－1的范圍時，隨著其質量濃度的增加K值呈直線上升，質量濃度在5～20 mg·L－1的范圍時，隨著其質量濃度的增加K值呈緩慢上升趨勢，質量濃度為20 mg·L－1時，K值達最大；質量濃度在20～30 mg·L－1的范圍時，隨著其質量濃度的增加，藻細胞的K值越來越小，但仍顯著高于對照組。硅鹽質量濃度范圍在5～30 mg·L－1時均可促進翼繭形藻的生長，其最適生長的質量濃度為20 mg·L－1，經單因素方差分析得知，Na2SiO3對翼繭形藻生長的影響極顯著（P＜0.01）。直鏈藻最佳的硅鹽質量濃度25 mg·L－1［10］；小環藻最佳的硅鹽質量濃度為25 mg·L－1［11］；日本星桿藻最佳的硅鹽質量濃度為10 mg·L－1［12］。

3.5 維生素B1、B12正交實驗

已有研究表明，維生素對微藻生長的影響因種類而異。王正方等［17］認為VB1、VB12和復合維生素是海洋原甲藻增殖的重要因素；胡桂坤等［18］指出VB1促小球藻分裂作用極顯著，VB12和VH無顯著影響。本實驗中維生素B1、B12對翼繭形藻生長影響的研究結果表明，維生素B1、B12單獨使用對翼繭形藻的生長無顯著影響，而維生素B1、B12混合使用對翼繭形藻的生長有極顯著影響（P＜0.01）。3號組合培養翼繭形藻的效果最好，即維生素B1、維生素B12最佳的質量濃度分別為0.100、0.050 mg·L－1。

3.6 優化培養基的驗證

優化培養基與“寧波大學3＃培養液”的對比培養實驗結果表明，翼繭形藻在優化培養基中顯示出較大的生長優勢，從接種的第2天至第7天，優化培養基培養的藻細胞密度均極顯著優于“寧波大學3＃培養液”培養的藻細胞密度（P＜0.01）。

4 小結

通過本實驗可知，翼繭形藻在人工培養時對各種營養鹽的需求如下：1）硝酸鈉、尿素和硫酸銨均可作為氮鹽，最適翼繭形藻生長的氮鹽為硝酸鈉，當培養液中氮質量濃度低于20 mg·L－1時硫酸銨培養效果最好，3種氮鹽對翼繭形藻生長的影響均極顯著；磷酸二氫鉀和磷酸二氫鈉均可作為磷鹽，培養效果相差不大，2種磷鹽對翼繭形藻生長均存在極顯著影響；檸檬酸鐵和硫酸亞鐵均可作為翼繭形藻的鐵鹽，2種鐵鹽對翼繭形藻生長均存在顯著影響；硅在翼繭形藻的培養中是必須的，培養液中加入硅鹽后能極顯著地促進翼繭形藻的生長；維生素B1、B12混合使用對翼繭形藻的生長有極顯著影響；優化培養基的培養效果極顯著優于“寧波大學3＃培養液”的培養效果。2）翼繭形藻的優化培養基：在天然海水中添加40 mg·L－1NaNO3-N、8 mg·L－1KH2PO4-P、0.5 mg ·L－1FeSO4-Fe、20 mg·L－1Na2SiO3-Si、0.1 mg ·L－1VB1和0.05 mg·L－1VB12。

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Screening and optim izing of the culturemedium of Amphiprora alata

SONG Bang-xing1，WANG Jun1，2，3，CHEN Guo-hua1，2，3，YANG Jin-hua1，XU Bing-liang1
（1.Ocean College，Hainan University，Haikou570228，China；2.Key Laboratory of Tropic Biological Resources，Ministry of Education，Haikou570228，China；3.Experimental Teaching Center of Marine Biology，Haikou570228，China）

Based on the Ningbo 3＃medium，a one-factor experiment and an orthogonal experiment were performed to analyze the effects of different nutrient sources and concentrations on the growth ofAmphiprora alata.The nutrient sources were（NH4）2SO4，NaNO3，and（NH2）2CO for nitrogen（N），KH2PO4and NaH2PO4for phosphorus（P），FeSO4and FeC6H5O7for iron（Fe），Na2SiO3for silicon（Si），VB1and VB12.The results showed that the optimum culturemedium based in naturemarine water was formulated as follows：40 mg·L－1NaNO3-N，8 mg·L－1KH2PO4-P，0.5 mg·L－1FeSO4-Fe，20 mg·L－1Na2SiO3-Si，0.1 mg ·L－1Vitamin B1and 0.05 mg·L－1Vitamin B12.The optimum culture medium was compared with the Ningbo 3＃culture medium，the results showed that this optimized medium could increase cell biomass productivity.Cultured from the second to the seventh day，the cell biomass ofAmphiprora alataincreased by 1.45，1.83，2.12，2.26，2.32 and 2.40 times respectively.

Amphiprora alata；culturemedium；optimization；growth

Q 949.270.5

A

1004－2490（2016）03－0297－07

2015－12－28

海南省科技項目（ZDYF2016087）；海南省重大科技項目（ZDZX2013009）

宋邦興（1991－），男，海南文昌人，水產養殖專業大學本科生。E-mail：389956767＠qq.com

王 珺，高級實驗師。E-mail：72206wj＠163.com