c-myc基因與急性髓性白血病的相關(guān)性研究

c-myc基因與急性髓性白血病的相關(guān)性研究

目的檢測(cè)c-myc基因在急性髓性白血病(AML)不同臨床階段的表達(dá)情況, 探討c-myc基因與AML的關(guān)系。方法20 例初診AML患者作為初診AML組, 16 例復(fù)發(fā)AML患者作為復(fù)發(fā)AML組, 10例外周血造血干細(xì)胞移植治療的AML患者作為對(duì)照組。檢測(cè)三組骨髓單個(gè)核細(xì)胞中c-myc基因的表達(dá)水平, 分析c-myc基因與AML不同臨床階段之間的關(guān)系。結(jié)果初診AML組與復(fù)發(fā)AML組治療前骨髓中單個(gè)核細(xì)胞的c-myc基因表達(dá)(1.12±0.26)、(0.97±0.18)高于對(duì)照組(0.27±0.08)(P＜0.05)；治療后達(dá)CR患者骨髓中單個(gè)核細(xì)胞的c-myc基因表達(dá)(0.38±0.24)、(0.49±0.12)較治療前下降(P＜0.05)；治療后未達(dá)CR患者骨髓中單個(gè)核細(xì)胞的c-myc基因表達(dá)(0.91±0.23)、(1.02±0.25)高于對(duì)照組(P＜0.05)；復(fù)發(fā)AML組再誘導(dǎo)治療后達(dá)CR患者骨髓中單個(gè)核細(xì)胞的c-myc基因表達(dá)(0.49±0.12)高于初診AML組誘導(dǎo)治療后達(dá)CR患者(0.38±0.24)和對(duì)照組(0.27±0.08)(P＜0.05)。結(jié)論c-myc基因高表達(dá)可能是AML發(fā)生與復(fù)發(fā)的機(jī)制之一, 其表達(dá)水平在AML患者病程監(jiān)測(cè)與預(yù)后判斷中具有重要意義。

c-myc基因；急性髓性白血病；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)；預(yù)后

急性白血病是因造血干細(xì)胞異常克隆性增生為表現(xiàn)的一類惡性腫瘤性疾病, 其主要病因在于各種因素導(dǎo)致造血干細(xì)胞失去往成熟血細(xì)胞分化的能力而停滯在細(xì)胞發(fā)育的某個(gè)階段不斷增殖。現(xiàn)階段多項(xiàng)研究已證實(shí)特定的分子生物學(xué)異常對(duì)AML具有臨床意義。c-myc基因是1982年Neel等［1］發(fā)現(xiàn)的一種癌基因, 具有刺激細(xì)胞增殖和凋亡的雙向調(diào)節(jié)作用。近年來研究表明在多種腫瘤細(xì)胞中, c-myc基因存在異常表達(dá)［2,3］。本研究應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)不同階段的AML骨髓單個(gè)核細(xì)胞的c-myc基因表達(dá)水平, 探討c-myc基因作為細(xì)胞生長周期的主要調(diào)控基因與AML的關(guān)系, 報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取 2012 年 1 月～2014 年 10 月江西省人民醫(yī)院血液內(nèi)科住院的初診AML患者 20 例作為初診AML組。根據(jù)FAB分型, M1型5例、M2型8例、M4型5例、M5型2例。男11例, 女9例, 平均年齡(37.4±5.6)歲。選取2012年 4月～2014 年 11 月該院復(fù)發(fā)AML患者 16 例作為復(fù)發(fā)AML組。根據(jù)FAB分型, M1型5例、M2型2例、M4型5例、M5型4例。男7例, 女9例, 平均年齡(32.2±7.6)歲。選取2010年1月～2014年5月該院外周血造血干細(xì)胞移植治療的AML患者10例作為對(duì)照組。男3例, 女7例, 平均年齡(27.8±8.3)歲。研究對(duì)象均為染色體核型分析正常者,診斷符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》［4］。三組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05), 具有可比性。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 總RNA提取試劑為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司生產(chǎn)；Taq DNA合成酶與美國Proega公司產(chǎn)品；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶與緩沖液為美國Promega公司產(chǎn)品；c-myc基因與actin引物的PCR擴(kuò)增引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；PCR儀、紫外分光光度儀、低溫離心機(jī)為美國 BIO-RAD公司生產(chǎn)；-80℃冰箱為Forma Scientific公司生產(chǎn)；水平電泳儀為英國Amersham Pharmarcia Biotech公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本提取 所有研究對(duì)象在無菌條件下抽取骨髓2 ml注入EDTA抗凝試管中, 用Hypague-Ficoll液密度梯度離心分離去除血清后計(jì)數(shù), 獲得的骨髓單個(gè)核細(xì)胞。取(1～2)×106個(gè)骨髓單個(gè)核細(xì)胞, PBS洗滌兩遍后加1 ml Trizol液, -80℃保存。

1.3.2 mRNA制備 按照TRIZOL試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA, 應(yīng)用微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定從各標(biāo)本中提取RNA的OD260/OD280值, 并計(jì)算RNA溶液的濃度, 比值在1.8～2.0之間的標(biāo)本進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取RNA 2 μg采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)進(jìn)行cDNA合成及反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品擴(kuò)增, 并用β-actin作為參照, 引物序列為：c-myc基因：上游序列：5’-ACAGCAAACCTCCTCACAG-3’, 下游序列：5’-CGCAACAAGTCCTCTTCAG-3’, 擴(kuò)增條帶為403bp；β-actin：上游引物：5’-ATGGCACCGTCAAGGCTGAG-3’；下游引物：5’-GCAGTGATGGCATGGACTGT -3’；擴(kuò)增條帶為379bp。反應(yīng)條件：95℃孵育10 min后； 以95℃孵育30 s, 退火至58℃孵育30 s, 72℃延伸30 s為1個(gè)循環(huán), c-myc反應(yīng)35個(gè)循環(huán), β-actin反應(yīng)25個(gè)循環(huán), 擴(kuò)增后72℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物4℃保存。

1.3.3 PCR產(chǎn)物分析 制備2%濃度的含溴化乙錠瓊脂糖凝膠, 并取10 μl實(shí)驗(yàn)所得PCR產(chǎn)物和DNA Marker?上樣至瓊脂糖凝膠中, 120 V穩(wěn)壓電泳40 min后用拍照并應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行灰度值測(cè)定。結(jié)果判斷以同時(shí)擴(kuò)增的內(nèi)參actin的表達(dá)強(qiáng)度為基準(zhǔn), c-myc的表達(dá)強(qiáng)度=c-myc基因灰度值/內(nèi)參actin灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示, 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

初診AML組與復(fù)發(fā)AML組治療前骨髓中單個(gè)核細(xì)胞的c-myc基因表達(dá)(1.12±0.26)、(0.97±0.18)高于對(duì)照組(0.27±0.08), 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)；治療后達(dá)CR患者骨髓中單個(gè)核細(xì)胞的c-myc基因表達(dá)(0.38±0.24)、(0.49±0.12)較治療前下降, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)；治療后未達(dá)CR患者骨髓中單個(gè)核細(xì)胞的c-myc基因表達(dá)(0.91±0.23)、(1.02±0.25)高于對(duì)照組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；復(fù)發(fā)AML組再誘導(dǎo)治療后達(dá)CR患者骨髓中單個(gè)核細(xì)胞的c-myc基因表達(dá)(0.49±0.12)高于初診AML組誘導(dǎo)治療后達(dá)CR患者的(0.38±0.24)和對(duì)照組的(0.27±0.08), 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。見表1, 2。

表1 初診AML組c-myc基因RT-PCR結(jié)果(±s)

表1 初診AML組c-myc基因RT-PCR結(jié)果(±s)

注：與對(duì)照組比較,aP＜0.05；與治療前比較,bP＜0.05

組別 時(shí)間 例數(shù) c-myc基因?qū)φ战M 10 0.27±0.08初診AML組 誘導(dǎo)治療前 20 1.12±0.26a誘導(dǎo)治療后達(dá)CR 13 0.38±0.24b誘導(dǎo)治療后未達(dá)CR 7 0.91±0.23a

表2 復(fù)發(fā)AML組c-myc基因RT-PCR結(jié)果(±s)

表2 復(fù)發(fā)AML組c-myc基因RT-PCR結(jié)果(±s)

注：與對(duì)照組比較,aP＜0.05；與治療前比較,bP＜0.05

組別 時(shí)間 例數(shù) c-myc基因?qū)φ战M 10 0.27±0.08復(fù)發(fā)AML組 再誘導(dǎo)治療前 16 0.97±0.18a再誘導(dǎo)治療后達(dá)CR 9 0.49±0.12b再誘導(dǎo)治療后未達(dá)CR 7 1.02±0.25a

3 討論

AML是一類造血干細(xì)胞異常克隆性增生為表現(xiàn)的惡性疾病, 可發(fā)生于各個(gè)年齡階段, 是青少年與兒童最常見的惡性腫瘤之一。急性白血病是因造血干細(xì)胞異常克隆性增生為表現(xiàn)的一類惡性腫瘤性疾病, 其主要病因在于各種因素導(dǎo)致造血干細(xì)胞失去往成熟血細(xì)胞分化的能力而停滯在細(xì)胞發(fā)育的某個(gè)階段不斷增殖。目前的資料顯示急性白血病約占腫瘤總發(fā)病率的3%左右。近年來得益于化療方案與支持治療的改進(jìn)和干細(xì)胞移植技術(shù)的進(jìn)展, AML的預(yù)后明顯得到改善, CR率明顯提高［5］。目前證實(shí)AML特定的分子生物學(xué)異常具有臨床意義, 對(duì)于預(yù)后不良的分子生物學(xué)異常, 采取特定的靶向治療, 是AML治療進(jìn)一步取得突破的一個(gè)重要方向。

c-myc基因是近年來醫(yī)療工作者研究最廣泛的癌基因之一, 其定位于人染色體8q24, 由3個(gè)外顯子組成, 屬核內(nèi)蛋白。c-myc基因通過其編碼的c-Myc蛋白, 廣泛作用于細(xì)胞生長、增殖、分化和凋亡等各個(gè)階段［6,7］, 是細(xì)胞生長周期重要的調(diào)控基因之一, 其異常表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)［8-10］。Guo 等［11］研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過c-myc基因敲除的小鼠出現(xiàn)明顯的造血異常, 其有核細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞與淋巴細(xì)胞明顯減少, 并伴有嚴(yán)重貧血和血小板增多, 證實(shí)了c-myc基因在髓系造血細(xì)胞分化中的作用。Delgado［12］等研究證實(shí)c-myc基因異常表達(dá)在白血病的發(fā)病和疾病進(jìn)程中起著重要作用。

Rice等［13］運(yùn)用染色體免疫沉淀啟動(dòng)基因陣列和基因表達(dá)譜分析相結(jié)合, 發(fā)現(xiàn)PLZF-RARa可促使小鼠造血干細(xì)胞的生長, 并抑制Dusp6和Cdkn2d, 同時(shí)誘導(dǎo)c-myc表達(dá), 解釋了c-myc基因在AML中表達(dá)增高的機(jī)制。陳萍等［14］發(fā)現(xiàn)AML與急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)的初診患者, c-myc基因表達(dá)均明顯高于健康對(duì)照, 且在AML初診患者中, c-myc基因的表達(dá)與FAB分型無相關(guān)性, 而與初診是外周血細(xì)胞數(shù)和骨髓中原始細(xì)胞比例呈正相關(guān), 在誘導(dǎo)化療后未達(dá)CR的患者明顯高于CR組。

在本次研究使用RT-PCR半定量的實(shí)驗(yàn)方法, 結(jié)果顯示, 初診AML組與復(fù)發(fā)AML組治療前骨髓中單個(gè)核細(xì)胞的c-myc基因表達(dá)(1.12±0.26)、(0.97±0.18)高于對(duì)照組(0.27±0.08), 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)；治療后達(dá)CR患者骨髓中單個(gè)核細(xì)胞的c-myc基因表達(dá)(0.38±0.24)、(0.49±0.12)較治療前下降, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)；治療后未達(dá)CR患者骨髓中單個(gè)核細(xì)胞的c-myc基因表達(dá)(0.91±0.23)、(1.02±0.25)高于對(duì)照組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；復(fù)發(fā)AML組再誘導(dǎo)治療后達(dá)CR患者骨髓中單個(gè)核細(xì)胞的c-myc基因表達(dá)(0.49±0.12)高于初診AML組誘導(dǎo)治療后達(dá)CR患者(0.38±0.24)和對(duì)照組(0.27±0.08), 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。c-myc基因在急性髓性白血病初次診斷時(shí)和復(fù)發(fā)時(shí)的表達(dá)明顯升高, 提示c-myc基因高表達(dá)可能是急性髓性白血病的發(fā)生與復(fù)發(fā)的機(jī)制之一。治療后完全緩解者c-myc基因表達(dá)水平下降, 復(fù)發(fā)患者c-myc基因表達(dá)水平再次升高, 且復(fù)發(fā)患者經(jīng)治療緩解后其c-myc基因表達(dá)水平雖有所下降但仍高于對(duì)照組和初治患者緩解后c-myc基因表達(dá)水平, 提示 c-myc基因表達(dá)水平在急性髓性白血病患者病程監(jiān)測(cè)與預(yù)后判斷中具有重要意義。

Lin等［15］研究發(fā)現(xiàn), c-myc基因抑制劑在臨床研究中顯現(xiàn)出良好的抗腫瘤效果。Roderick等［16］報(bào)道, 抑制c-myc基因能夠阻止白血病的發(fā)生, 并改善常規(guī)治療失敗的急性T淋巴細(xì)胞白血病患者的預(yù)后。

綜上所述, 隨著醫(yī)學(xué)研究的進(jìn)一步開展, 采用針對(duì)抑制c-myc基因的治療策略, 并動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)AML患者的c-myc基因水平, 有可能改善AML患者的預(yù)后, 進(jìn)一步提高AML患者的緩解率與治愈率。

［1］Neel BG, Jhanwar SC, Chaganti RSK, et al.Two human c-onc genes are located on the long arm of chromosome 8.Proc Natl Acad Sci, 1982, 79(24):7842-7846.

［2］Dang CV.c-Myc target genes involved in cell growth, apoptosis, and metabolism.Mol Cell Biol , 1999, 19(1):1-11.

［3］吳一飛, 李灼日.原癌基因c-Myc與惡性腫瘤.醫(yī)學(xué)臨床研究, 2008, 25(9):1698-1700.

［4］張之南, 沈悌.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn).第3版.北京：科學(xué)出版社, 2008: 232..

［5］沈志祥, 王建祥, 金潔.急性髓系白血病治療專家共識(shí).中華血液學(xué)雜志, 2010, 31(1):69-70.

［6］Cassimere EK, Pyndiah S, Sakamuro D.The c-MYC-interacting proapoptotic tumor suppressor BIN1 is a transcriptional target for E2F1 in response to DNA damage.Cell Death Differ, 2009, 16(12):1641-1653.

［7］Acehan D, Jiang X, Morgan DG, et al.Three-dimensional structure of the apoptosome: implications for assembly, procaspaseations for assembly, procaspase-9 binding, and activation.Mol Cell, 2002, 9(2):423-432.

［8］Malempati S, Tibbitts D, Cunningham M, et al.Aberrant stabilization of c-Myc protein in some lymphoblastic leukemias.Leukemia, 2006, 20(9):1572-1581.

［9］Scandurra M, Rossi D, Deambrogi C, et al.Genomic profiling of Richter's syndrome: recurrent lesions and differences with de novo, diffuse large B-cell lymphomas.Hematol Oncol, 2010, 28(2):62-67.

［10］畢慧, 王亞軍, 何勤.急性白血病細(xì)胞C-myc基因表達(dá)的研究.白血病:淋巴瘤, 2003, 12(2):73-75.

［11］Guo Y, Niu C, Breslin P, et al.c-Myc-mediated control of cell fate in megakaryocyte-erythrocyte progenitors.Blood, 2009, 114(10): 2097-2106.

［12］Delgado MD, Albajar M, Gomez-Casares MT, et al.MYC oncogene in myeloid neoplasias.Clin Transl oncol, 2013, 15(2):87-94.

［13］Rice KL, Hormaeche I, Doulatov S, et al.Comprehensive genomic screens identify a role for PLZF-RARalpha as a positive regulator of cell proliferation via direct regulation of c-MYC.Blood, 2009, 114(27):5499-5511.

［14］陳萍, 叢雅琴, 王昭, 等.急性白血病患者垂體瘤轉(zhuǎn)化基因和c-myc基因表達(dá)的研究.中華血液學(xué)雜志, 2005, 26(7):427-428.

［15］Lin CP, Liu JD, Chow JM, et al.Small-molecule c-Myc inhibitor, 10058-F4, inhibits proliferation, downregulates human telomerase reverse transcriptase and enhances chemosensitivity in human hepatocellular carcinoma cells.Anticancer Drugs, 2007, 18(2):161-170.

［16］Roderick JE, Tesell J, Shultz LD, et al.c-Myc inhibition prevents leukemia initiantion in mice and impairs the growth of relapsed and induction failure pediatric T-ALL cells.Blood, 2014, 123(7):1040-1050.

Research of correlation between c-myc gene and acute myeloid leukemia

WEI Yu-jing, PAN Jie, LIU Ting-ting, et al.
School of Basic Medicine, Wuhan University, Wuhan 430071, China

ObjectiveTo detect expression of c-myc gene in different clinical stages of acute myeloid leukemia (AML), and to investigate relationship between c-myc gene and AML.MethodsThere were 20 preliminarily diagnosed AML patients as preliminarily diagnosed AML group, 16 recurrent AML patients as recurrent AML group, and 10 AML patients in peripheral blood stem cell transplantation treatment as control group.Expression levels of c-myc gene in bone marrow mononuclear cells were detected in all three groups, and their relationship between c-myc gene and different clinical stages of AML were analyzed.ResultsThe preliminarily diagnosed AML group and the recurrent AML group all had higher expression of c-myc gene in bone marrow mononuclear cells as (1.12±0.26) and (0.97±0.18) than (0.27±0.08) in the control group (P＜0.05).Expression of c-myc gene in bone marrow mononuclear cells was lower as (0.38±0.24) in complete remission (CR) cases after treatment than (0.49±0.12) in those before treatment (P＜0.05).They had higher expression of c-myc gene in bone marrow mononuclear cells as (0.91±0.23) and (1.02±0.25) in non-CR cases after treatment than the control group (P＜0.05).The recurrent AML group had higher expression of c-myc gene in bone marrow mononuclear cells as (0.49±0.12) in CR cases after inductive treatment than (0.38±0.24) of CR cases in the preliminarily diagnosed AML group after inductive treatment and (0.27±0.08) of the control group (P＜0.05).ConclusionHigh expression of c-myc gene may be one of mechanisms of occurrence and recurrence of AML, and it contains important significance in disease monitoring and prognosis judgment for AML patients.

c-myc gene; Acute myeloid leukemia; Reverse transcription-polymerase chain reaction; Prognosis

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.15.001

2016-05-17］

430071 武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(魏宇靖)；江西省人民醫(yī)院血液科(魏宇靖 潘婕 劉婷婷 柯波 萬才水 程洪波)