阿托伐他汀對局灶性腦缺血大鼠腦組織中自噬及血管新生的影響*

王金蘭，樂　婷，閆瑩瑩，劉海燕

鄭州大學第二附屬醫院神經內科 鄭州450014

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阿托伐他汀對局灶性腦缺血大鼠腦組織中自噬及血管新生的影響*

王金蘭，樂婷#，閆瑩瑩，劉海燕

鄭州大學第二附屬醫院神經內科 鄭州450014

關鍵詞阿托伐他??；局灶性腦缺血；大鼠；自噬；肌醇酶1；LC3-Ⅱ；血管新生

摘要目的：觀察阿托伐他汀對局灶性腦缺血大鼠腦組織中自噬及血管新生的影響。方法：雄性SD大鼠63只，隨機分為假手術組、模型組、他汀組，每組21只。模型組和他汀組采用大腦中動脈栓塞法造模，假手術組不栓塞。術前1周，他汀組給予阿托伐他汀鈣片4 mg/(kg·d)灌胃，其余兩組給予等量生理鹽水灌胃。術后24 h處死大鼠，TTC染色觀察腦梗死面積，免疫組化法檢測腦組織中CD105、IRE1的表達，RT-PCR檢測血管內皮細胞生長因子(VEGF) mRNA， Western blot法檢測自噬蛋白LC3-Ⅱ。結果：與假手術組相比，模型組及他汀組腦組織皮層及皮層下有明顯梗死灶，缺血半暗帶區CD105、IRE1、VEGF mRNA、LC3-Ⅱ表達升高(P<0.05)；他汀組上述變化較模型組更顯著(P<0.05)。模型組、他汀組腦組織中VEGF mRNA與LC3-Ⅱ表達有明顯線性正相關關系(r=0.837、0.850，P均<0.05)。結論：阿托伐他汀可通過增強自噬，促進局灶性腦缺血血管新生。

AbstractAim: To observe the effect of atorvastatin on autophagy and angiogenesis in brain tissue of focal cerebral ischemia rats.Methods: A total of 63 male SD rats were randomly allocated into sham operation group, model group and treatment group, and each group contained 21 rats.One week before surgery, the treatment group received a gavage of atorvastatin at 4 mg/(kg·d), and the other 2 groups were given the same amount of normal saline. All rats were killed 24 h after operation. The area of cerebral infarction was measured by TTC staining. The expressions of CD105 and IRE1 protein in brain tissue were detected by immunohistochemistry. The expression of VEGF mRNA was detected by RT-PCR. The expression of LC3-Ⅱprotein was detected by Western blot.Results: Compared with those of sham operation group, the cortex and subcortical brain tissue of model group and treatment group showed obvious infarction.The expressions of CD105,IRE1,VEGF mRNA and LC3-Ⅱ in ischemic penumbra area in model group and treatment group were higher. Compared with those of the model group,the indexes mentioned above in treatment group were much higher(P<0.05). In model group and treatment group, the expression of LC3-Ⅱ and that of VEGF mRNA had positive linear relationship (r=0.837,0.850,P<0.05).Conclusion: Atorvastatin can promote angiogenesis in focal cerebral ischemia tissue by enhancing autophagy.

治療缺血性腦卒中的第一要務是盡早恢復缺血區血供，搶救缺血半暗帶,但對于錯過溶栓窗口期及其他原因不適合溶栓的患者，恢復缺血區血供主要依靠缺血組織的代償性血管新生。自噬(autophagy)是一種利用溶酶體將胞內已衰老、過?；驀乐厥軗p的生物大分子(如蛋白質)及細胞器清除、降解和回收利用的過程。研究[1]表明3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑(他汀)可通過上調NO水平促進血管新生。在缺血心肌細胞、癌細胞、結核分枝桿菌感染的巨噬細胞、冠狀動脈管壁肌細胞中，他汀類藥物與自噬的關系復雜[2-5]；而無論是在整體水平還是在細胞水平，自噬均參與了缺血后血管新生的過程[6]。而他汀類藥物對缺血后腦組織內血管新生有何影響，其是否可通過調節內質網應激、增強自噬起作用而促血管新生，目前尚不清楚。血管內皮生長因子(VEGF)是內皮細胞最具特異性的生長因子，在體內外均可誘導血管新生；CD105是新生血管內皮細胞特異性標志物，常用于測定微血管密度。肌醇酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)是哺乳動物內質網膜上感應和傳遞未折疊蛋白反應的感應蛋白之一，內質網應激激活后可通過IRE1信號通路調節自噬，所以IRE1可反映體內自噬激活水平；微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)可與自噬體膜結合，LC3-Ⅱ水平可反映自噬體的數量[7]。作者擬觀察阿托伐他汀對局灶性腦缺血大鼠腦組織IRE1、LC3-Ⅱ表達及血管新生的影響，探討他汀類藥物、自噬與血管新生的關系。

1材料與方法

1.1實驗動物及試劑雄性SD大鼠63只，體重(300±20) g，購自河南省實驗動物中心，合格證號SCXK(豫)2010-0002。兔抗鼠CD105抗體、兔抗鼠IRE1抗體、兔抗鼠LC3-Ⅱ抗體、羊抗兔SP二抗試劑盒、羊抗兔IgG抗體均購自美國Santa Cruz公司， RT-PCR試劑盒、Trans DNA Marker Ⅰ購自北京Transgene公司。阿托伐他汀鈣片由北京嘉林藥業股份有限公司生產，生產許可證號H19990258。

1.2實驗分組及模型建立方法采用隨機數字表法將大鼠分為假手術組、模型組、他汀組，每組21只。采用大腦中動脈栓塞法制備局灶性腦缺血模型。大鼠經水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，頸部備皮、消毒，頸部正中切口，分離左側頸總動脈(CCA)、頸內動脈(ICA)、頸外動脈(ECA)，結扎ECA遠心端，動脈夾夾閉CCA及ICA，剪斷ECA，沿ECA殘端向ICA插入魚線，進入長度達17.5～18.5 mm時，可感阻力，停止插線，ECA殘端結扎并固定魚線。清理切口，逐層縫合。術后白熾燈直接照射，保持肛溫在37 ℃。模型組和他汀組按上述方法造模。假手術組只分離，不結扎，不插線。術前1周，他汀組給予阿托伐他汀4 mg/(kg·d)灌胃，其余兩組給予等量生理鹽水灌胃。

1.3標本采集及保存所有大鼠術后24 h處死。每組隨機選取1只用于紅四氮唑(TTC)染色。隨機選取10只大鼠，經心臟灌注多聚甲醛后取腦，多聚甲醛固定24 h后，選取視交叉后6 mm組織常規脫水、透明、浸蠟、包埋。參考文獻[8]的方法，在距額葉前端3 mm和9 mm處進行冠狀切片；取中間6 mm厚的腦組織塊，然后沿此腦塊矢狀縫右側約2 mm處，從上至下切去右側半球的正中結構，余下的左側腦塊再沿矢狀切面旁開2 mm處、并與矢狀切面呈30°斜切，其中外側皮層為缺血核心區，內側皮層為缺血半暗區，常規制備石蠟切片，厚度5 μm。其余10只斷頭處死、新鮮取腦，選取左側大腦半球視交叉后6 mm組織液氮迅速冷凍，并保存于-80 ℃冰箱中。

1.4TTC染色斷頭取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，將大腦從前向后冠狀切5刀分為6片，TTC染色。

1.5檢測指標

1.5.1腦組織CD105和IRE1蛋白的檢測采用免疫組化SP法。石蠟切片常規脫蠟、水化，高壓抗原修復5 min，自然冷卻，滴加體積分數8%山羊血清封閉，加兔抗鼠CD105多克隆一抗(130稀釋)50 μL，室溫下孵育60 min；加生物素標記羊抗兔IgG二抗(1100稀釋)50 μL/片，室溫孵育60 min，DAB顯色，蘇木精復染，脫水，透明及封片。100倍鏡下選取5個不重復視野，400倍鏡下進行平均光密度(LOD)測定。同樣方法檢測IRE1蛋白，一抗1150稀釋，二抗1100稀釋。

1.5.2腦組織VEGF mRNA的檢測采用RT-PCR法。Trizol一步法提取總RNA，用紫外分光光度計定量，取少量進行RNA含量及純度測定。總RNA用RNase H處理后，進行cDNA 的合成及PCR反應。VEGF引物序列為5’-GCTGTACCTCCACCATGCCAAGT-3’和5’-CACGCACTCCAGGGCTTCAT-3’，GAPDH引物序列為5’-AAGTTCAACGGCACAGT CAA-3’和5’-CGCCACAGCTTTCCAGAGGG-3’。PCR共進行35個循環(94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min)，72 ℃總延伸6 min。產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外線投射儀下拍照，用D-140圖像記錄分析系統進行分析，目的基因mRNA的表達量=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.5.3腦組織LC3-Ⅱ蛋白的檢測采用Western blot法。把左側大腦半球視交叉后6 mm新鮮組織剪切成小塊，按5～10 μL/mg加入蛋白裂解液，14 000 r/min離心5 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，每孔上樣30 μL，樣品分離后轉移至PVDF膜，100 V恒壓80 min，硝酸纖維素封閉。按11 000稀釋兔抗鼠LC3-Ⅱ一抗，4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜，按14 000稀釋羊抗兔IgG抗體，37 ℃孵育45 min，TBS洗膜、蒸餾水漂洗后，ECL顯影，暗室壓片。以GAPDH為內對照。將膠片掃描后用Bandscan 5.0進行灰度分析。目的蛋白表達量=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.6統計學處理采用SPSS 17.0對數據進行統計分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法,計量資料相關分析采用Pearson積矩相關，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1TTC染色假手術組大鼠腦組織未見梗死灶，呈均勻一致紅色；模型組和他汀組大鼠左側大腦半球皮層和皮層下可見明顯白色梗死灶，右側大腦半球腦組織正常呈紅色，且他汀組各層面梗死面積均小于模型組，見圖1。

2.23組腦組織CD105和IRE1蛋白的表達免疫組化染色結果見圖2。假手術組可見少量散在的CD105陽性細胞，呈棕黃色；極少量IRE1陽性細胞。模型組可見中等量CD105陽性細胞，且可見少量新生血管，呈管腔樣；IRE1陽性細胞增多。他汀組可見大量CD105陽性細胞，且管腔樣新生血管增多；可見大量IRE1陽性細胞。他汀組、模型組CD105和IRE1蛋白表達較假手術組升高，他汀組較模型組升高(表1)。

2.33組腦組織VEGF mRNA和LC3-Ⅱ蛋白的表達見圖3、圖4和表2。他汀組、模型組腦組織VEGF mRNA和LC3-Ⅱ蛋白表達較假手術組升高，他汀組較模型組升高。

1:假手術組 2:模型組 3:他汀組。圖1　腦組織TTC染色

2.43組腦組織中VEGF mRNA與LC3-Ⅱ蛋白表達的相關分析假手術組腦組織中VEGF mRNA與LC3-Ⅱ蛋白表達不存在線性相關(r=-0.263,P=0.462),而模型組和他汀組腦組織中VEGF mRNA與LC3-Ⅱ蛋白表達之間存在線性正相關(r=0.837,P=0.003；r=0.850,P=0.002)。

表1　3組間CD105和IRE1蛋白表達的比較

*:與假手術組比較，P<0.05；#:與模型組比較，P<0.05。

A:假手術組;B:模型組;C:他汀組。圖2　3組腦組織CD105(1)和IRE1(2)蛋白表達(SP,×400)

1:假手術組;2:模型組;3:他汀組。圖3　3組腦組織VEGF mRNA的表達

1:假手術組;2:模型組;3:他汀組。圖4　3組腦組織LC3-Ⅱ蛋白的表達

表2　3組腦組織

*:與假手術組比較，P<0.05；#:與模型組比較，P<0.05。

3討論

近年來研究[7]表明內質網應激可誘導細胞自噬，且主要通過IRE1通路，同時自噬也可以負反饋調節內質網應激，避免內質網應激過強，但過度的自噬同樣可以導致自噬性細胞死亡。LC3是自噬標志性蛋白，其表達水平可反映自噬體的數量。

該研究結果顯示：模型組腦組織中CD105及VEGF mRNA表達較假手術組增加，說明局灶性腦缺血后缺血半暗帶區存在血管新生現象，這與以往學者研究[8]結論相吻合。他汀組腦組織中CD105及VEGF mRNA表達較模型組增加，說明阿托伐他汀通過上調VEGF表達，促進了缺血半暗帶區的血管新生。進一步研究發現，假手術組腦組織中僅少量表達IRE1和LC3-Ⅱ,模型組IRE1和LC3-Ⅱ的表達高于假手術組，說明腦缺血可以激活內質網應激和自噬；他汀組腦組織中IRE1和LC3-Ⅱ表達高于模型組，說明阿托伐他汀可增強腦缺血后內質網應激和自噬效應。 作者還發現，在模型組和他汀組腦組織中VEGF mRNA與LC3-Ⅱ的表達均呈正相關關系，提示血管新生與自噬有關。

該研究中阿托伐他汀上調自噬的現象與張圣雪等[9]研究結果相悖，后者認為阿托伐他汀通過抑制血管內皮細胞的自噬,從而改善血管內皮細胞功能。也有研究[2]認為他汀可以抑制腫瘤組織的轉移，此效應與其增強自噬有關。而Sabe等[2]研究發現，在患有代謝綜合征的奧斯薩巴豬體內，阿托伐他汀可促進非缺血區心肌細胞自噬，抑制缺血區心肌細胞自噬。以往研究對他汀和自噬關系的看法不盡相同，但都未明確損傷因素作用時間，也就是自噬發生時間。自噬是一把雙刃劍，一方面可維持細胞內環境穩定，另一方面則可導致細胞自噬性死亡，而利弊的關鍵取決于自噬的發生時間。有研究[10]表明損傷因素作用后24 h內，自噬多為保護性因素，而24 h以后，自噬則轉化為損傷性因素，導致細胞死亡。張圣雪等用Hanks液替代培養基培養30 min，誘導血管內皮細胞發生自噬，盡管時間在24 h之內，但其細胞直接暴露于無培養液的Hanks液中，短時間內足以導致自噬性死亡。而此次研究是在整體水平上的研究，機體可有一定代償機制，所以并不能否認阿托伐他汀可通過IRE1途徑上調自噬蛋白LC3-Ⅱ，進而促進局灶性腦缺血組織血管新生。

綜上所述，作者認為阿托伐他汀可通過內質網應激中IRE1通路上調自噬，促進血管新生。但該研究僅對VEGF mRNA與LC3-Ⅱ蛋白做了相關分析，對于判定二者的因果關系仍有不足，可以在今后研究中給予相應激活劑和阻滯劑，進一步明確阿托伐他汀促進血管新生的機制。

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*鄭州大學第二附屬醫院院內基金資助(2015年)

Effect of atorvastatin on autophagy and angiogenesis in brain tissue of focal cerebral ischemia rats

WANGJinlan，YUETing,YANYingying,LIUHaiyan

DepartmentofNeurology,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014

Key wordsatorvastatin;focal cerebral ischemia;rat;autophagy;inositol-requiring enzyme 1;LC3-Ⅱ;angiogenesis

中圖分類號R743

通信作者#，女，1987年2月生，碩士研究生，住院醫師，研究方向：腦血管疾病，E-mail:563556741@qq.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.030