sirt2基因高表達對人臍帶間充質干細胞衰老的抑制作用*

馬珊珊，崔淵博，姚　寧，邢　衢，韓　康，宋及時，張彥婷，關方霞

1)鄭州大學生命科學學院干細胞研究室 鄭州 450001　2)鄭州大學附屬鄭州中心醫院轉化醫學中心 鄭州 450007　3)鄭州大學第一附屬醫院干細胞研究室 鄭州450052

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sirt2基因高表達對人臍帶間充質干細胞衰老的抑制作用*

馬珊珊1)，崔淵博2)，姚寧1)，邢衢1)，韓康1)，宋及時1)，張彥婷1)，關方霞1,3)#

1)鄭州大學生命科學學院干細胞研究室 鄭州 4500012)鄭州大學附屬鄭州中心醫院轉化醫學中心 鄭州 4500073)鄭州大學第一附屬醫院干細胞研究室 鄭州450052

關鍵詞sirt2；腺病毒；人臍帶間充質干細胞；衰老

摘要目的：觀察sirt2基因高表達對人臍帶間充質干細胞(hUC-MSCs)衰老的影響。方法：擴增人sirt2 ORF序列，利用腺病毒載體構建sirt2基因高表達的重組腺病毒(pAd-sirt2)，空斑法測定病毒滴度；感染hUC-MSCs，倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況；實驗分為P3組(第3代hUC-MSCs)、P15組(第15代hUC-MSCs)和感染組(用pAd-sirt2腺病毒感染第15代hUC-MSCs)，CCK-8檢測細胞增殖情況，流式細胞術分析細胞周期變化，β-半乳糖苷酶染色后檢測陽性細胞率。結果：成功制備pAd-sirt2重組腺病毒，病毒滴度為1.8×1011pfu/L；熒光觀察證實Sirt2蛋白在hUC-MSCs中有效表達；與P15組相比，sirt2高表達可促進hUC-MSCs增殖，并將細胞周期阻滯在S期，β-半乳糖苷酶陽性細胞率降低(P均<0.05)。結論：sirt2基因高表達可促進hUC-MSCs增殖，延長細胞周期，并有效抑制hUC-MSCs的衰老。

AbstractAim: To construct a recombinant adenovirus containing sirt2 gene and to explore the impact of sirt2 overexpression on the aging of human umbilical cord mesenchymal stem cells(hUC-MSCs). Methods: Human sirt2 ORF was generated by RT-PCR and the recombinant adenovirus(pAd-sirt2) was constructed.The viral titer was determined by air-dilution method.After being transfected into hUC-MSCs, the green fluorescence was observed under fluorescence microscope. hUC-MSCs were allocated into P3 group(P3 hUC-MSCs), P15 group(P15 hUC-MSCs) and transfected group(transfected hUC-MSCs by pAd-sirt2). CCK-8 assay was performed to detect the proliferation of hUC-MSCs and flow cytometry, to analyze the cell cycle. SA-β-Gal was used to detect the cell senescence. Results: The recombinant adenovirus was constructed and the titer was 1.8×1011pfu/L. After infection by pAd-sirt2, P15 hUC-MSCs expressed green fluorescence protein clearly under the fluorescence microscope. Compared with P15 group, sirt2 overexpression could promote the cell proliferation, induced more cells at S phase,and decrease the positive rate of SA-β-Gal(P<0.05). Conclusion: sirt2 overexpression could promote hUC-MSCs proliferation,extend cell cycle,and inhibit cell senescence.

人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)具有自我更新和多向分化潛能，為脊髓損傷、腦損傷等神經系統疾病的治療帶來希望[1-2]。但是體外培養的hUC-MSCs同正常細胞一樣，也會呈現衰老變化，從而限制干細胞的使用[3]。研究發現sirt2參與調控微管蛋白、P53、細胞周期蛋白依賴性激酶的乙酰化[4-5]，進而延緩細胞和機體的衰老[6]。但是sirt2在干細胞衰老中的作用和機制還不清楚。課題組前期研究[7]發現衰老的hUC-MSCs中sirt2的表達降低。因此，該實驗構建含有人sirt2基因的重組腺病毒，觀察sirt2高表達對hUC-MSCs增殖和細胞周期的影響，初步探討sirt2對hUC-MSCs的抗衰老作用。

1材料與方法

1.1材料和試劑CCK-8、β-半乳糖苷酶染色試劑盒購自碧云天生物技術公司；引物設計和測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；Trizol、逆轉錄和qRT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司。hUC-MSCs為作者所在的實驗室前期分離、鑒定和傳代培養的細胞。

1.3重組腺病毒的擴增吸取5 μL包裝好的腺病毒，感染80%融合的HEK293 細胞，常規培養 3～5 d，當 HEK293細胞出現明顯的細胞病變時，收集細胞，于液氮、37 ℃反復凍融4次，每次10～15 min，12 000 r/min離心1 min后取上清，即得到在HEK293細胞中擴增的腺病毒，反復感染HEK293細胞即可獲得大量腺病毒。

1.4重組腺病毒的滴度測定采用空斑法測定病毒滴度。pAd-sirt2腺病毒原液用DMEM/高糖培養基以10倍梯度依次稀釋，取20 μL各濃度病毒感染80%融合的HEK293細胞，每組3個復孔，使病毒稀釋液與細胞充分接觸，37 ℃細胞培養箱中孵育1 h后棄培養液，每孔加入1 mL瓊脂培養基使其均勻覆蓋細胞，待瓊脂培養基凝固后將板置于培養箱中繼續孵育；每天定時觀察各孔中空斑形成情況并計數1次，待空斑數目穩定不變(7～10 d)時停止；根據發生細胞完全病變的孔中的細胞數量計算腺病毒滴度。

1.5pAd-sirt2感染hUC-MSCs取第15代hUC-MSCs，用MOI為10 的pAd-sirt2感染第15代hUC-MSCs作為感染組，以正常培養的第15代hUC-MSCs為對照組(P15組)，每組3個復孔。將2組細胞置于37 ℃、體積分數5%CO2細胞培養箱中培養，48 h后用熒光倒置顯微鏡觀察細胞形態變化和熒光表達情況。

1.6Western blot檢測Sirt2蛋白的表達收集上述感染組和P15組細胞，用RAPI裂解獲得總蛋白，BCA法測量蛋白濃度，進行SDS-PAGE電泳。電泳結束后切取目的蛋白條帶，以200 mA轉膜1.5 h后于50 g/L脫脂奶粉溶液中室溫封閉1 h，Sirt2一抗(11 000稀釋)、內參β-actin一抗(1500稀釋)4 ℃過夜孵育，TBST洗膜3次,每次15 min。用辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL化學發光顯影成像。

1.7CCK-8法檢測pAd-sirt2對hUC-MSCs增殖的影響實驗分為3組，分別為P3組(正常培養的第3代hUC-MSCs)、P15組(正常培養的第15代hUC-MSCs)和感染組(pAd-sirt2感染第15代hUC-MSCs)，將細胞接種于96孔板，每孔各接種約2 500個細胞，每組3個復孔。分別于第1、2、3、4、5天避光下每孔加10 μL CCK-8溶液并繼續培養2 h，酶標儀檢測450 nm處的吸光度(OD)值，繪制各組細胞的生長曲線。

1.8PI染色法檢測pAd-sirt2對hUC-MSCs細胞周期的影響細胞分組及處理同1.7。取1 mL、2×106mL-1的各組細胞懸液，離心去上清，PBS清洗后加入1 mL預冷的體積分數70%乙醇固定過夜。預冷PBS清洗加入0.5 mL PI染色液,37 ℃避光孵育30 min。流式細胞儀檢測細胞周期變化。

1.9衰老相關β-半乳糖苷酶染色細胞分組及處理同1.7。棄各組細胞的培養液，加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，4 ℃固定30 min；PBS洗滌3次后每孔加入1 mL染色工作液，37 ℃孵育過夜。100倍鏡下選取5個視野觀察藍染細胞，即陽性的衰老細胞，并計算陽性細胞率。

1.10統計學處理采用SPSS 19.0分析數據。采用單因素方差分析比較各組細胞的細胞周期分布和β-半乳糖苷酶陽性細胞率，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1重組腺病毒pAd-sirt2的構建所提的RNA具有清晰的28S和18S條帶，滿足實驗要求(圖1左)。RT-PCR擴增出大小為1 200 bp的特異性條帶(圖1中)，測序驗證為人sirt2 ORF序列。pAdTrack-CMV-sirt2質粒與pAdEasy1在BJ5183菌體內同源重組后，PacⅠ酶切得到1條大于23 000 bp的片段和1條4 500 bp的片段(圖1右)。

左：P3組和P15組hUC-MSCs總RNA提取結果;中:RT-PCR擴增人sirt2 ORF序列;右:pAd-sirt2質粒電泳圖。M：Marker；1：pAd-sirt2同源重組質粒；2：PacⅠ酶切重組質粒。 圖1　重組腺病毒pAd-sirt2的構建

2.2pAd-sirt2的滴度測定結果見圖2。利用空斑法測定pAd-sirt2的滴度為1.8×1011pfu/L。

A：正常培養的HEK293細胞；B:轉染48 h后熒光顯微鏡下觀察；C：轉染48 h后。圖2　pAd-sirt2轉染HEK293細胞(×100)

2.3pAd-sirt2感染hUC-MSCs結果見圖3，說明pAd-sirt2腺病毒已經進入hUC-MSCs并在細胞中成功表達。

A：感染組可見光下觀察結果(×100)；B：感染組熒光顯微鏡下觀察結果(×100)；C：Western blot檢測Sirt2蛋白的表達。圖3　pAd-sirt2感染hUC-MSCs 48 h后檢測結果

2.4pAd-sirt2對hUC-MSCs增殖的影響結果見圖4。

圖4　各組細胞生長曲線

2.5hUC-MSCs感染pAd-sirt2后細胞周期的變化結果見表1。由表1可知，pAd-sirt2感染hUC-MSCs后將細胞周期阻滯在S期。

2.6各組細胞β-半乳糖苷酶染色結果見圖5、表2。

表1　各組細胞周期的變化　%

*：與P3組相比，P<0.05；#：與P15組相比，P<0.05。

A:P3組；B:P15組；C：感染組。圖5　各組細胞β-半乳糖苷酶染色結果(×100)

表2　各組細胞β-半乳糖苷酶陽性細胞率比較　%

F=913.570，P<0.001；*：與P3組相比，P<0.05；#：與P15組相比，P<0.05。

3討論

干細胞衰老學說認為體內外的干細胞隨著傳代次數或者年齡的增加，其增殖和分化能力降低，相關基因表達發生改變[8-9]，呈現衰老特征。Sirt2 是哺乳動物沉默信息調節因子家族成員之一，參與調控細胞周期、衰老等過程。實驗室前期研究[7]發現sirt2與hUC-MSCs的衰老有關。因此，該研究采用腺病毒載體系統構建pAd-sirt2重組腺病毒，研究sirt2高表達對hUC-MSCs衰老的影響。與普通質粒載體和逆轉錄病毒載體相比，腺病毒載體通過包裝腺病毒以感染的方式實現轉染，具有自帶熒光標簽方便檢測、重組效率高、宿主范圍廣泛、轉染效率高等特點[10]。pAd-sirt2感染P15 hUC-MSCs 48 h后即可觀察到明顯的熒光，且Sirt2蛋白表達明顯升高，說明腺病毒感染hUC-MSCs的效率非常高。另外作者發現，pAd-sirt2能夠將細胞周期阻滯在S期，延長細胞分裂期，促進增殖，衰老特異的β-半乳糖苷酶染色陽性細胞率明顯降低。該結果與以往研究[11-12]發現的sirt2激活細胞周期檢測點激酶進而延長壽命的結果具有一致性。

綜上，該研究發現sirt2高表達可以抑制hUC-MSCs的衰老，為進一步探索細胞衰老的機制和尋求有效延緩干細胞衰老的方法及途徑奠定了基礎。

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*國家自然科學基金資助項目U1404313，81471306；河南省高校科技創新團隊基金資助項目15IRTSTHN022；河南省科技創新人才計劃基金

資助項目154200510008

Inhibition of sirt2 overexpression on aging of human umbilical cord mesenchymal stem cells

MAShanshan1),CUIYuanbo2),YAONing1),XINGQu1),HANKang1),SONGJishi1),ZHANGYanting1),GUANFangxia1,3)

1)StemCellLaboratory,CollegeofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)TranslationalMedicineCenter,theAffiliatedZhengzhouCentralHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450007

3)StemCellLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordssirt2;adenovirus;human umbilical cord mesenchymal stem cell;aging

中圖分類號Q291

通信作者#，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向：生物醫學，E-mail:guanfangxia@126.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.003