酵母雙雜交技術篩選杜氏鹽藻cDNA文庫中與S-腺苷高半胱氨酸水解酶相互作用的蛋白*

李慶華,張彥婷,朱立強,柴丹丹,關方

1)鄭州大學生命科學學院 鄭州 450001　2)鄭州大學第二附屬醫院檢驗科 鄭州 450014

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酵母雙雜交技術篩選杜氏鹽藻cDNA文庫中與S-腺苷高半胱氨酸水解酶相互作用的蛋白*

1)鄭州大學生命科學學院 鄭州 4500012)鄭州大學第二附屬醫院檢驗科 鄭州 450014

關鍵詞S-腺苷高半胱氨酸水解酶;酵母雙雜交;蛋白相互作用;免疫共沉淀

摘要目的：應用酵母雙雜交技術篩選杜氏鹽藻cDNA文庫中能與S-腺苷高半胱氨酸水解酶(dsSAHH)相互作用的蛋白。方法：將構建好的pGBKT7-dsSAHH誘餌載體轉化至酵母細胞Y187，與轉化有杜氏鹽藻cDNA文庫的酵母細胞AH109雜交，從杜氏鹽藻cDNA文庫中篩選出能與dsSAHH相互作用的蛋白質。擴增所得基因片段全長，并在原核內表達該融合蛋白。隨后采用Far-western blot、His pull-down及免疫共沉淀方法驗證dsSAHH與目的蛋白在體內、外的相互作用。結果：以dsSAHH為誘餌篩選出3個陽性克隆，擴增得到dsRACK1、dsMetAP1和dseEF1α 3個新基因。His pull-down和免疫共沉淀體內外實驗證實dsRACK1能與dsSAHH相互作用。結論：dsRACK1是dsSAHH的相互作用蛋白。

AbstractAim: To isolate and identify the proteins that interact with S-adenosyhomocystine hydrolase(dsSAHH) in Dunaliella salina(D.salina) cDNA library. Methods: The constructed bait vector pGBKT7-dsSAHH was transformed to yeast cell Y187 and then the Y187 cells hybridized with yeast AH109 cells which contained the cDNA library of D.salina. The proteins that interacted with dsSAHH of D.salina were screened and identified using yeast two-hybrid technology. Then, the full length of screened gene was cloned and the fusion proteins of aimed gene were expressed in E.coli. Finally, the interaction was confirmed by Far-western blot, His pull-down, and co-immunoprecipitation in vitro and in vivo. Results: Three new genes, including dsRACK1, dsMetAP1, and dseEF1α, were screened. Out of them, dsRACK1 interacted with dsSAHH，which was confirmed by Far-western bolt and His pull-down. Conclusion: dsSAHH could interact with dsRACK1.

S-腺苷高半胱氨酸水解酶(S-adenosyhomocystine hydrolase, SAHH)是生物體內廣泛存在的一種蛋白水解酶，是甲基化通路中催化S-腺苷高半胱氨酸水解的惟一酶[1]。鑒于它在調節生物體轉甲基化反應中的核心位置，目前已經被選作多種新藥研發的重要潛在作用靶點[2]。單細胞綠藻杜氏鹽藻是一種高度耐鹽的單細胞真核生物，具有一對等長的鞭毛。研究[3]發現杜氏鹽藻SAHH(dsSAHH)蛋白參與了杜氏鹽藻鞭毛的組裝過程。為了進一步研究dsSAHH在杜氏鹽藻鞭毛組裝過程中的作用機制，作者利用已構建酵母雙雜交的誘餌載體pGBKT7-dsSAHH[4]對杜氏鹽藻cDNA文庫進行篩選來釣取與dsSAHH相互作用的蛋白質，為研究杜氏鹽藻中甲基化過程以及甲基化過程在杜氏鹽藻鞭毛組裝過程中的作用打下基礎。

1材料與方法

1.1 材料DH5α、杜氏鹽藻cDNA文庫、pET28a(+)載體和pGEX 6p-1載體均為鄭州大學細胞生物學研究室保存；pMD18-T載體、限制性內切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ、BamHⅠ、NotⅠ和DNA Marker 均購于大連TaKaRa公司；YPD液體和固體培養基以及DO Supplement系列均購于上海睿星基因技術有限公司；Yeast Nitrogen Base、X-α-gal、DMSO、IPTG、Ni-IDA SefinoseTM試劑盒和GST-IDA SefinoseTM試劑盒等均購于上海生工生物工程技術服務有限公司。酵母菌株AH109及Y187、酵母雙雜交所用載體、對照質粒、酵母質粒提取試劑盒均購于Clontech公司。

1.2SAHH相互作用蛋白的篩選

1.2.1誘餌載體篩選cDNA文庫將含有pGBKT7-SAHH誘餌載體的Y187酵母細胞和1 mL文庫菌共培養，并鏡檢是否形成三葉草狀配子，然后分別取200 μL的雜交液涂布50個直徑15 cm的SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT(5 mmol/L)培養基，30 ℃孵育6～8 d。待在SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT(5 mmol/L)/X-α-gal的四缺培養基上長出克隆后，挑取直徑大于2 mm的白色或粉色菌落并再次劃線于SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT(5 mmol/L)/X-α-gal的四缺培養基上，多次傳代并穩定表達的為陽性克隆。合成pGADT7載體上多克隆位點兩端序列作為上下游引物：STMARTⅢ，5’-AAGCAGTGGTATCAACG CAGAGTGGCCATTATGGCC-3’；CDSⅢ，5’-TCTA GAGGCCGAGGCGGCCGACATG-3’。并以此對引物對陽性克隆進行菌落PCR擴增，亞克隆至pMD18-T載體，而后轉化DH5α，酶切鑒定并比對結果。

1.2.2回交實驗選擇含有dsRACK1的酵母菌落，劃線到新的SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT(5 mmol/L)固體培養基，選擇直徑大于2 mm 的酵母菌落提取質粒。然后將其提取的酵母質粒轉化DH5α并涂布含有Ampr的LB固體培養基，然后提取質粒，用限制性內切酶Hind Ⅲ酶切鑒定正確后送公司測序。

將提取的獵物質粒pGADT7-dsRACK1與誘餌載體pGBKT7-dsSAHH用醋酸鋰法共轉化酵母細胞AH109，涂布于SD/-Trp-Leu培養基，同時做陽性對照(質粒pGBKT7-53和 pGADT7-Rec-LargeT)和陰性對照(質粒pGBKT7-53與pGADT7-Rec-Lam)實驗。培養3～5 d長出白色克隆后，將其劃線到SD/-Trp-Leu-His-Ade/X-α-gal培養基上，繼續培養并觀察結果。

1.3dsSAHH相互作用蛋白的驗證

1.3.1dsRACK1基因擴增及蛋白質表達和純化采用Trizol試劑法提取杜氏鹽藻總RNA[5]，采用TaKaRa 公司的5’RACE試劑盒合成5’RACE模板，設計RACK1 5’引物，擴增RACK1的全長。然后設計引物構建重組表達載體pGEX 6p-1-dsRACK1。將pGEX 6p-1-dsRACK1重組質粒和已構建的pET28a-dsSAHH分別轉化BL21 DE3[6]，挑取單菌落分別接種到含有相應抗生素的4 mL LB培養基中，37 ℃振蕩培養約8 h后，以150接種擴大培養2 h后加入IPTG(終濃度為0.05 mmol/L)，16 ℃過夜誘導蛋白表達。收集細菌后超聲磨碎，收集沉淀和上清，SDS-PAGE檢測蛋白，考馬斯亮藍G-250染色，確定重組蛋白的大小及是否為可溶性蛋白質。

將含有目的蛋白質的可溶性蛋白質分別進行純化，pGEX 6p-1-dsRACK1含有GST標簽，使用GST-IDA Sefinose試劑盒純化dsRACK1；pET28a(+)-dsSAHH上含有His標簽，用Ni-IDA Sefinose試劑盒純化dsSAHH。

1.3.2Far-western blot實驗將純化的dsRACK1蛋白經SAS-PAGE后，將凝膠上的蛋白質用半干法轉至硝酸纖維素膜上后，并進行膜上的原位逐步復性[7]：將膜依次在鹽酸胍濃度依次降低(6.0、3.0、1.0、0.1 mol/L)的復性緩沖液TNAB中溫育30 min后，將膜轉移至TNAB中4 ℃過夜。然后將膜放置在純化的SAHH蛋白質封閉液中孵育3 h，TBST漂洗3次后再與SAHH多克隆抗體(一抗)封閉液室溫振蕩孵育1 h，室溫下用TBST洗膜，再與辣根過氧化物標記的山羊抗兔抗體(二抗)室溫溫育1 h，最后用ECL發光顯色后曝光掃描。

1.3.3His pull-down及非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳將純化的SAHH蛋白質重新掛柱，然后將純化的dsRACK1加入到預裝柱中，4 ℃過夜孵育，然后用洗脫液將多余的dsRACK1洗脫，最后用洗脫液將dsSAHH從柱子上洗脫下來，收集蛋白質。

將pull-down洗脫的蛋白質用4×上樣Buffer稀釋，配制60 g/L的非變性聚丙烯酰胺凝膠(不含SDS)，為防止蛋白質變性，將電泳槽置于冰上，100 V電壓不加樣品預跑1 h后再加入樣品，濃縮膠電壓為200 V，分離膠電壓為250 V，凝膠用考馬斯亮藍G-250染色、掃描。

1.3.4免疫共沉淀分別構建pCMV-HA-dsSAHH和pCMV-Myc-dsRACK1質粒，經鑒定正確后，提取大量質粒。按照說明書，pCMV-HA-dsSAHH和pCMV-Myc-dsRACK1質粒共同轉染至COS-7細胞中。培養2 d后提取COS-7細胞總蛋白，將細胞裂解產物與已和Myc抗體孵育過的瓊脂糖蛋白小珠A充分混合，用洗脫液將免疫復合物洗脫，用已制備的抗-dsSAHH抗體采用Western blot檢測免疫復合物中的dsSAHH，而共轉染pCMV-HA和pCMV-Myc的COS-7蛋白為陰性對照。

2結果

2.1誘餌載體同cDNA文庫雙雜交轉化有誘餌質粒pGBKT7-dsSAHH的酵母細胞Y187與轉化pGADT7-文庫質粒的酵母細胞AH109雜交20 h后，取少量的雜交液鏡檢可看到三葉草狀的二倍體酵母細胞，說明酵母雙雜交成功。

酵母雙雜交液涂布SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT的培養基進行初步篩選，培養6～8 d后，挑取255個較大的克隆劃線SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT/X-α-gal培養基，后經過多次穩定傳代得到8個陽性克隆。以CDS Ⅲ和STMART Ⅲ為引物對陽性克隆進行PCR擴增, 連接載體酶切測序，通過Blast得到3個可能與dsSAHH相互作用的克隆，經測序后初步鑒定為dsRACK1、甲硫氨酰氨肽酶(dsMetAP1)和真核延伸因子1α(dseEF1α)(圖1)。

M:Marker；1：dsRACK1；2：dseEF1α；3：dsMetAP1。圖1　以CDS Ⅲ和STMART Ⅲ為引物對陽性克隆酵母行PCR檢測結果

2.2回交實驗驗證dsSAHH與dsRACK1在酵母內相互作用提取pGADT7-dsRACK1質粒，Hind Ⅲ酶切結果見圖2，測序結果提示正確。

1: pGADT7-dsRACK1酶切結果；2:pGADT7-dsRACK1；M:Marker。圖2　質粒pGADT7-dsRACK1被Hind Ⅲ酶切的結果

將提取的酵母質粒pGADT7-dsRACK1和誘餌質粒pGBKT7-dsSAHH用醋酸鋰法共轉化酵母細胞AT109并涂布SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT培養基培養3～5 d，挑取生長良好的菌落再次劃線SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT/X-α-gal培養基培養，細胞生長良好且變藍。

2.3與dsSAHH相互作用蛋白的驗證

2.3.1dsRACK1全長的獲得及蛋白表達采用5’RACE試劑盒合成的5’RACE模板，設計引物擴增得到RACK1基因序列全長957 bp(GenBank:JN540811)。并成功構建帶有GST標簽的融合表達載體pGEX 6p-1-dsRACK1(圖3)，同時誘導表達了pGEX 6p-1-dsRACK1和pET28a(+)-dsSAHH，通過一系列條件優化均獲得了可溶性的融合蛋白，并分別進行了純化(圖4)。

2.3.2體外驗證dsSAHH與dsRACK1的相互作用

①Far-western blot：結果見圖5A，dsRACK1在膜上變性的條件下可以和dsSAHH相互作用。②非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳：結果見圖5B，在2個蛋白大小上面還有一團聚合狀的蛋白質存在，說明dsRACK1和dsSAHH在體外活性條件下存在相互作用。

2.3.3體內驗證dsSAHH與dsRACK1的相互作用

將pCMV-HA-dsSAHH和pCMV-Myc-dsRACK1質粒共轉到Cos-7細胞，dsSAHH和dsRACK1在Cos-7細胞中共表達(圖5C)，即dsSAHH和dsRACK1在細胞內也能相互作用。

1：pGEX 6p-1-dsRACK1酶切結果；2：pGEX 6p-1-dsRACK1質粒；M：Marker。圖3　pGEX 6p-1-dsRACK1酶切圖

M：Marker；1：pET28a(+)空載體純化結果；2：dsSAHH純化結果(左)。M：Marker；1：dsRACK1純化結果(右)。圖4　dsSAHH和dsRACK1純化

A：Far-western blot結果，NC表示陰性對照；B：pull-down結果，1和2為洗脫下來的相互作用蛋白；C：免疫共沉淀結果。圖5 dsSAHH和dsRACK1相互作用的驗證結果

3討論

在酵母雙雜交系統中，酵母細胞作為真核細胞為2個相互作用的蛋白質提供了更接近于天然構象和功能的蛋白[7-8]。其相互作用比較靈敏，假陽性較高，因此需要進一步的實驗來驗證酵母雙雜交的結果，一般方法有pull-down和免疫共沉淀。

該研究用已構建的pGBKT7-dsSAHH誘餌載體在Y187酵母細胞中表達了dsSAHH蛋白，與含有杜氏鹽藻cDNA文庫的AH109酵母細胞進行了2次雜交：第1次篩選出了dsRACK1，第2次篩選出了dsRACK1以及dsMetAP1和dseEF1α共3個蛋白質。通過了2次雜交實驗減少了酵母雙雜交的假陽性，因此作者選擇了dsRACK1來進行回交實驗，并且對dsRACK1進行蛋白表達，通過Far-western blot和pull-down實驗證明dsRACK1與dsSAHH在體內、外都存在相互作用。

為了更好地了解dsSAHH和dsRACK1之間的相互作用，作者分別將dsSAHH和dsRACK1氨基酸序列在NCBI上進行比對，結果發現dsSAHH具有保守的NAD+結合位點，這與它的水解功能是密不可分的，而dsRACK1的蛋白序列包含一個WD40結構域，是WD40家族蛋白。RACK1最初被認為是蛋白激酶C的受體[9]，酵母和哺乳動物中RACK1的信號轉導和翻譯調控作用已得到證實[10]，但目前認為RACK1同多個信號蛋白有關系[11-15]。基于該研究結果，作者推測dsSAHH可能通過與dsRACK1相互作用參與鞭毛的組裝過程。在后續的研究中作者將要制備dsRACK1的抗體，通過分子生物學手段來研究dsRACK1在杜氏鹽藻鞭毛再生中的作用及dsSAHH-dsRACK1的相互作用對鞭毛再生的影響。

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*科技部國際科技合作基金資助項目2007DFA01240；河南省高等學校重點科研項目計劃15A310028，15A180022

Screening of proteins that interact with S-adenosyhomocystine hydrolase by yeast two-hybrid assay inDunaliellasalinacDNA library

1)CollegeofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)ClinicalLaboratory,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014

Key wordsS-adenosyhomocystine hydrolase;yeast two-hybrid;protein interaction;co-immunoprecipitation

中圖分類號Q781

通信作者#，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向：生物醫學，E-mail：guanfangxia@126.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.002