Egr-1對妊娠期糖尿病大鼠肝臟組織中PEPCK和G-6-Pase mRNA表達(dá)的影響*

趙繼紅，王崇賢，辛雅萍，張?zhí)K河，付艷芹

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 鄭州 450014

?

Egr-1對妊娠期糖尿病大鼠肝臟組織中PEPCK和G-6-Pase mRNA表達(dá)的影響*

趙繼紅，王崇賢，辛雅萍，張?zhí)K河#，付艷芹

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 鄭州 450014

關(guān)鍵詞胰高血糖素；妊娠期糖尿病；糖異生；早期應(yīng)激蛋白-1；大鼠

摘要目的：探討Egr-1是否參與妊娠期糖尿病(GDM)大鼠肝臟糖異生。方法：45只健康SD雌性大鼠隨機(jī)分為正常飲食非孕鼠組(NC組)、正常飲食孕鼠組(NGT組)、高脂高糖飲食孕鼠組(GDM組)，每組15只。妊娠第21天，應(yīng)用全自動生化檢測儀檢測空腹血糖(FPG)，ELISA法測定空腹胰島素(FINS)、空腹胰高血糖素(FHGF)，并計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。應(yīng)用RT-PCR檢測肝臟組織中Egr-1和PEPCK、G-6-Pase mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：與NC組比較，NGT組、GDM組大鼠HOMA-IR、FHGF和肝臟組織中Egr-1、PEPCK、G-6-Pase mRNA表達(dá)水平均升高(P均<0.05)；與NGT組比較，GDM組大鼠HOMA-IR、FHGF和肝臟組織中Egr-1、PEPCK、G-6-Pase mRNA表達(dá)水平均升高(P均<0.05)。在GDM組大鼠中，肝臟Egr-1的表達(dá)與FHGF、PEPCK和G-6-Pase的表達(dá)均呈正相關(guān)(r=0.855、0.975和0.897，P均<0.05)。結(jié)論：Egr-1通過影響胰高血糖素調(diào)控的肝臟糖異生參與GDM的發(fā)病。

AbstractAim: To explore whether early growth response protein-1(Egr-1) engages in gluconeogenesis in liver of gestational diabetes mellitus(GDM) ras.Methods: A total of 45 healthy SD female rats were randomly allocated into three groups：normal diet virgin rat(NC) group,normal diet pregnant rat(NGT) group,high sucrose and fat diet pregnant rat(GDM) group.On the 21st day of gestation, fasting plasma glucose(FPG) was tested by fully automatic biochemical detector, ELISA was employed for the examination of serum fasting insulin(FINS) and serum fasting glucagon(FHGF), and IR index(HOMA-IR) was calculated.RT-PCR technology was utilized to assess the levels of Egr-1, PEPCK, and G-6-Pase mRNA in liver.Results: The mice of both the NGT and the GDM groups had much higher levels of HOMA-IR, FHGF and PEPCK, Egr-1, G-6-Pase mRNA in liver than those of the NC group(P<0.05).Nevertheless, HOMA-IR, FHGF and PEPCK, Egr-1, G-6-Pase mRNA levels in liver of mice in the GDM group were significantly higher compared with those of the NGT group(P<0.05). In the GDM group, there were positive correlations between the level of Egr-1 mRNA in liver and FHGF, PEPCK or G-6-Pase mRNA(r=0.855,0.975,0.897,P<0.05).Conclusion: Egr-1 engages in the development of GDM through impacting the gluconeogenesis controlled by glucagon.

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)發(fā)病率在全球范圍內(nèi)逐年上升，其對母嬰近期及遠(yuǎn)期危害均較嚴(yán)重。GDM的發(fā)病機(jī)制與2型糖尿病(T2DM)相似，其中肝臟糖異生的異常被認(rèn)為是T2DM重要的致病因素[1]。肝臟糖異生主要受胰高血糖素調(diào)控[2-3]。研究[4]顯示，隨著胰高血糖素濃度的增加，早期應(yīng)激蛋白-1(early growth response protein-1，Egr-1)的表達(dá)也增加，并且胰高血糖素可調(diào)節(jié)肝臟糖異生關(guān)鍵酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)及6-磷酸葡萄糖脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G-6-Pase)的表達(dá)水平，促進(jìn)肝臟糖異生，從而導(dǎo)致體內(nèi)糖代謝紊亂。作者建立了一種GDM動物模型，檢測其空腹胰高血糖素(FHGF)及肝臟組織中Egr-1、PEPCK、G-6-Pase mRNA表達(dá)水平，研究胰高血糖素參與肝臟糖異生的機(jī)制，為臨床上靶向治療GDM提供新的思路。

1材料與方法

1.1實驗動物選取及分組實驗動物為購于河南省實驗動物中心的4周齡SD雌性大鼠45只和雄性大鼠10只(體重180～200 g)，飼料為普通飼料(標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類)及高脂高糖飼料[5]。將45只健康雌性SD大鼠先用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，然后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組(n=15)：正常飲食非孕鼠組(NC組)、正常飲食孕鼠組(NGT組)、高脂高糖飲食孕鼠組(GDM組)。所有大鼠均不限制食、水。喂養(yǎng)6周之后，將孕鼠組與雄性SD大鼠按照21的比例合籠，次晨鏡檢精子(+)判為妊娠第1天，標(biāo)記后隔離孕鼠。雄性大鼠均用普通飼料喂養(yǎng)。

1.2大鼠FHGF、空腹血糖(FPG)和空腹胰島素(FINS)及胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)的檢測妊娠第21天時所有大鼠隔夜禁食12 h以上，腹腔注射麻醉，取股靜脈血，4 ℃、3 000 r/min離心10 min分離血清，置于-20 ℃冰箱保存待測。采用全自動生化檢測儀檢測FPG，采用FINS ELISA檢測試劑盒(美國貝克曼庫爾特有限公司)測定FINS，由此計算HOMA-IR，采用FHGF ELISA檢測試劑盒(北京北方生物科技研究所)測定FHGF。

1.3大鼠肝臟組織中Egr-1和PEPCK、G-6-Pase mRNA表達(dá)水平的測定大鼠采血后立即處死(頸椎脫臼法)，取新鮮肝臟組織迅速置于液氮中凍存24 h 后，-80 ℃保存。應(yīng)用RT-PCR法檢測肝臟組織中Egr-1和PEPCK、G-6-Pase mRNA的表達(dá)。取約100 mg肝臟組織放入液氮中研磨至細(xì)顆粒狀，加入Trizol 1 mL，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，取2 μL cDNA 作為模板行PCR 擴(kuò)增。RT-PCR引物見表1。反應(yīng)條件:94 ℃ 預(yù)變性2 min；94 ℃ 變性及退火各30 s(Egr-1和PEPCK、G-6-Pase 退火溫度均為55 ℃，GAPDH 為55 ℃)，72 ℃延伸2 min，共35 個循環(huán)；72 ℃總延伸6 min。取5 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，EB 染色，應(yīng)用紫外線投射儀觀察電泳條帶，應(yīng)用D-140 圖像記錄分析系統(tǒng)計算目的基因的相對表達(dá)量。

表1　RT-PCR引物

1.4統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。3組間FPG、FINS、HOMA-IR、FHGF及Egr-1、PEPCK、G-6-Pase mRNA相對表達(dá)量的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；GDM組大鼠肝臟組織中Egr-1 mRNA相對表達(dá)量與FHGF、肝臟組織中PEPCK和G-6-Pase mRNA相對表達(dá)量的關(guān)系采用Pearson直線相關(guān)性進(jìn)行分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.13組大鼠FPG、FINS 和HOMA-IR 的比較結(jié)果見表2。與NC組比較，NGT組、GDM組大鼠FPG、FINS和HOMA-IR均升高；與NGT組比較，GDM組大鼠FPG、FINS和HOMA-IR均升高。

表2　3組大鼠FPG、FINS 和HOMA-IR 的比較

#：與NC組比較，P<0.05；*：與NGT組比較，P<0.05。

2.23組大鼠FHGF和肝臟組織中Egr-1、PEPCK、G-6-Pase mRNA表達(dá)水平的比較結(jié)果見圖1及表3。與NC組比較，NGT組和GDM組大鼠FHGF和肝臟組織中Egr-1、PEPCK、G-6-Pase mRNA表達(dá)水平均升高；與NGT組比較，GDM組大鼠FH-GF和肝臟組織中Egr-1、PEPCK、G-6-Pase mRNA表達(dá)水平均升高。

1：NC組；2：NGT組；3：GDM組。圖1　大鼠肝臟組織中Egr-1(上)、PEPCK(中)、G-6-Pase(下)mRNA的表達(dá)水平

組別nρ(FHGF)/(ng·L-1)Egr-1PEPCKG-6-PaseNC組15215.70±22.070.154±0.0110.103±0.0080.132±0.009NGT組15252.42±17.34#0.265±0.016#0.176±0.011#0.191±0.014#GDM組15332.07±23.14#*0.621±0.035#*0.479±0.028#*0.578±0.033#*F120.3861766.1671338.4691803.311P<0.001<0.001<0.001<0.001

#：與NC組比較，P<0.05；*:與NGT組比較，P<0.05。

2.3GDM組大鼠肝臟組織中Egr-1 mRNA相對表達(dá)量與FHGF、肝臟組織中PEPCK和G-6-Pase mRNA相對表達(dá)量的相關(guān)性GDM組大鼠肝臟組織中Egr-1 mRNA的相對表達(dá)量與FHGF呈正相關(guān)(r=0.855，P=0.020)，與肝臟組織中PEPCK和G-6-Pase mRNA的相對表達(dá)量均呈正相關(guān)(r=0.975和0.897，P均<0.001)。

3討論

T2DM的主要表現(xiàn)是FPG的異常升高，而影響FPG水平的主要因素是胰高血糖素調(diào)節(jié)的肝臟糖異生[6-7]。最新研究[4]表明，Egr-1的表達(dá)隨著胰高血糖素濃度的增加而增加，此外胰高血糖素可以調(diào)節(jié)肝臟糖異生關(guān)鍵酶PEPCK及G-6-Pase的表達(dá)水平，促進(jìn)肝臟糖異生，從而導(dǎo)致體內(nèi)糖代謝紊亂。Egr-1是一種轉(zhuǎn)錄因子，含有3個鋅指結(jié)構(gòu),在肝臟及脂肪組織中分布，可以通過調(diào)控下游基因參與T2DM的發(fā)病過程[8]。肝臟糖異生是GDM形成的重要原因。妊娠期，胰腺胰高血糖素分泌增多，但關(guān)于其是否通過調(diào)控Egr-1調(diào)節(jié)肝臟糖異生，并參與GDM的發(fā)病，相關(guān)研究卻較少。

該研究結(jié)果顯示：NGT組大鼠 HOMA-IR較NC組升高，這是由于在正常妊娠中晚期，體內(nèi)激素發(fā)生巨大變化，許多升糖激素(如雌激素、孕激素等)分泌增多，胰島素分泌相對增加，形成一種生理性胰島素抵抗，以保證胎兒可以獲得足夠的葡萄糖；GDM組大鼠HOMA-IR較NC組及NGT組明顯升高，提示妊娠期高脂高糖飲食使胰島β細(xì)胞代償性分泌的胰島素發(fā)生失代償，加重胰島素抵抗，提示造模成功[9]。與NC組比較，NGT組大鼠FHGF升高，可能因為妊娠時期機(jī)體的代謝需求增加,導(dǎo)致胰島α細(xì)胞代償性增多；與NGT組比較，GDM組大鼠FHGF明顯升高，這可能是由于GDM患者胰島素水平偏高或正常，α細(xì)胞長期處于高胰島素環(huán)境中，發(fā)生病理性胰島素抵抗，削弱了胰島素抑制α細(xì)胞分泌胰高血糖素的正常負(fù)反饋機(jī)制, 從而導(dǎo)致血液中胰高血糖素升高[10]。另外，NC組、NGT組及GDM組大鼠FPG及肝臟組織中PEPCK、G-6-Pase mRNA表達(dá)水平依次增高，這是由于胰高血糖素調(diào)節(jié)的肝臟糖異生是影響FPG的主要因素，而在GDM中胰高血糖素異常升高，引起肝臟糖異生關(guān)鍵酶生成增多，從而導(dǎo)致FPG升高。該研究結(jié)果還顯示：在GDM組中，Egr-1 mRNA的表達(dá)與FHGF呈正相關(guān)，PEPCK和G-6-Pase mRNA的表達(dá)與Egr-1 mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)，提示胰高血糖素可能通過調(diào)控Egr-1通路調(diào)節(jié)了肝臟糖異生關(guān)鍵酶PEPCK及G-6-Pase的表達(dá)，促進(jìn)糖異生。

目前，臨床上藥物治療GDM除了應(yīng)用胰島素外，尚無其他治療方法。Egr-1作為胰高血糖素介導(dǎo)的肝臟糖異生調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子，與GDM大鼠模型中的糖異生關(guān)鍵酶PEPCK和G-6-Pase的表達(dá)呈正相關(guān)。那么通過靶向調(diào)控Egr-1減少肝臟糖異生，是否會延緩GDM的發(fā)生發(fā)展，能否成為GDM治療的新靶點，為GDM的預(yù)防及治療提供新的途徑，有待進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)

[1]KIM DK,GANG GT,RYU D,et al.Inverse agonist of nuclear receptor ERRγ mediates antidiabetic effect through inhibition of hepatic gluconeogenesis[J].Diabetes,2013,62(9):3093

[2]EDGERTON DS,CHERRINGTON AD.Glucagon as a critical factor in the pathology of diabetes[J].Diabetes,2011,60(2):377

[3]CRYER PE.Minireview:glucagon in the pathogenesis of hypoglycemia and hyperglycemia in diabetes[J].Endocrinology,2012,153(3):1039

[4]沈?qū)?早期應(yīng)激蛋白Egr-1及其相關(guān)信號通路調(diào)控機(jī)體血糖穩(wěn)態(tài)的研究[D].南京:南京大學(xué),2013.

[5]李變鋒,付艷芹,張東銘,等.飲食干預(yù)對高脂高糖誘導(dǎo)的妊娠期大鼠胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2013,48(4):499

[6]HANCOCK AS,DU A,LIU J,et al.Glucagon deficiency reduces hepatic glucose production and improves glucose tolerance in adult mice[J].Mol Endocrinol,2010,24(8):1605

[7]WANG MY,CHEN L,CLARK GO,et al.Leptin therapy in insulin-deficient type Ⅰ diabetes[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(11):4813

[8]CRONIGER CM,MILLWARD C,YANG J,et al.Mice with a deletion in the gene for CCAAT/enhancer-binding protein beta have an attenuated response to cAMP and impaired carbohydrate metabolism[J].J Biol Chem,2001,276(1):629

[9]李變鋒,辛亞萍,王崇賢,等.高脂高糖喂養(yǎng)誘導(dǎo)妊娠期胰島素抵抗大鼠模型的建立與評價[J].廣東醫(yī)學(xué),2013,34(11):1667

[10]杜瑞琴,李宏亮,楊文英,等.胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因表達(dá)的改變與α細(xì)胞胰島素抵抗的實驗研究[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2006,86(36):2542

*河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計劃基金資助項目201403091

Implication of Egr-1 on mRNA expressions of PEPCK and G-6-Pase in liver from mice with gestational diabetes mellitus

ZHAOJihong,WANGChongxian,XINYaping,ZHANGSuhe,FUYanqin

DepartmentofEndocrinology，theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450014

Key wordsglucagon；gestational diabetes mellitus；gluconeogenesis；early growth response protein-1；mouse

中圖分類號R587.1

通信作者#，女，1956年2月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向：妊娠期糖尿病，E-mail：zhangsuhe@126.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.018