結直腸癌KRAS、NRAS和BRAF 基因突變與病理特征、吸煙和飲酒之間的相關性*

吳新新，馬　杰，任鵬飛，郭曉萱，郭永軍

鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院分子病理科 鄭州 450003

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結直腸癌KRAS、NRAS和BRAF 基因突變與病理特征、吸煙和飲酒之間的相關性*

吳新新，馬杰，任鵬飛，郭曉萱，郭永軍#

鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院分子病理科 鄭州 450003

關鍵詞結直腸癌；基因突變；病理特征；KRAS；NRAS；BRAF；吸煙；飲酒

摘要目的：探討 KRAS、NRAS和BRAF基因在結直腸癌中的突變率，分析3種基因突變與結直腸癌病理特征、吸煙和飲酒之間的關系。方法：用石蠟組織DNA提取試劑盒提取DNA，應用實時熒光定量PCR技術檢測結直腸癌組織中KRAS 2號外顯子的12密碼子和13密碼子常見的7個突變位點，檢測NRAS 2號與3號外顯子的12密碼子、13密碼子與61密碼子常見的12個突變位點，檢測BRAF 15號外顯子的V600E位點的突變，分析KRAS、NRAS和 BRAF 基因在結直腸癌中的突變率與病理特征、吸煙和飲酒之間的相關性。結果：KRAS、NRAS和BRAF基因的突變率分別為38.0%(93/242)、5.0%(12/237)和2.1%(5/237)。在147例KRAS 野生型病例中NRAS與BRAF的突變頻率為6.8%(10/147)和3.4%(5/147)。BRAF與KRAS、NRAS基因突變相互排斥。KRAS基因突變更傾向發(fā)生于Duke′S分期的C期(P=0.047)和淋巴結轉(zhuǎn)移的患者(P=0.049)，與年齡、性別、腫瘤部位、組織學類型、分化程度、遠處轉(zhuǎn)移、癌結節(jié)及AJCC分期等病理特征無關(P均>0.05)。NRAS和BRAF基因突變與病理特征無關(P均>0.05)。KRAS、NRAS和BRAF 基因突變與吸煙及飲酒史無關(P>0.05)。結論：該研究中KRAS基因突變更傾向發(fā)生淋巴結轉(zhuǎn)移和Duke′S C期，說明KRAS基因突變對轉(zhuǎn)移性結直腸癌有更重要的臨床意義。

AbstractAim: To discuss KRAS, NRAS and BRAF gene mutation rates in colorectal cancer and to analyze the relationship between KRAS, NRAS and BRAF gene mutation and the pathological features smoking and drinking of patients with colorectal cancer.Methods: DNA was extracted with paraffin tissue DNA extraction kit, real-time fluorescent quantitative PCR technology was used to detect 7 mutations in codons 12, 13 of exon 2 of KRAS,12 mutations in codons 12, 13 and 61 of exon 2, 3 of NRAS, and BRAF mutation in V600E of exon 15 in colorectal cancer tissue, and to analyze the relationship between KRAS, NRAS and BRAF gene mutation and pathological features, smoking, and drinking in patients with colorectal cancer.Results: KRAS, NRAS and BRAF gene mutation rate was 38.0%(93/242), 5.0%(12/237), 2.1%(5/237), respectively. Among 147 patients with wild-type KRAS, the mutation rate of NRAS was 6.8%(10/147), and BRAF was 3.4% (5/147). BRAF, KRAS and NRAS mutation was mutually exclusive. KRAS mutation was more likely occurred in the Duke′S stage C patients(P=0.047) and lymph node metastasis patients(P=0.049),and there was no significant relation between KRAS mutation and age, gender, tumor location, histological type, differentiation degree, distant metastasis, nodules, or AJCC staging(P>0.05). And there was no significant relation between NRAS and BRAF gene mutation and pathological features(P>0.05). KRAS, NRAS and BRAF gene mutation was not obviously associated with a history of smoking or drinking(P>0.05).Conclusion: In this study,the KRAS gene more likely occurs in patients with lymph node metastasis and Duke′S C period, indicating that KRAS gene mutation has more important clinical significance for metastatic colorectal cancer.

*河南省科技創(chuàng)新型人才工程資助項目

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見的消化道腫瘤之一，近年來應用基因檢測的方法判斷CRC預后及指導基因靶向治療已成為重要手段。其中RAS基因是表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)信號通路中的關鍵性靶點，在CRC演變過程中發(fā)揮了重要作用[1]?？笶GRE抗體(西妥昔單抗和帕尼單抗)主要與內(nèi)源性配體競爭性結合EGFR，阻斷下游的RAS信號通路產(chǎn)生抗腫瘤效應。研究[2]顯示只有攜帶KRAS野生型的CRC患者才能從抗EGRE治療中獲益。因此KRAS基因突變狀態(tài)成為預示CRC患者能否從抗EGRE治療中獲益的有效指標,但是仍然有一部分KRAS野生型基因攜帶者無法從抗EGFR治療中獲益，這表明在EGFR下游的RAS-RAF-MAPK和 PI3-KAKT-mTOR信號傳導通路中存在的其他突變基因(例如NRAS、BRAF、PIK3CA和PTEN基因突變)可能導致CRC患者無法從抗EGRE治療中獲益，因此，研究CRC中KRAS/NRAS/BRAF基因突變情況，將對臨床治療具有重要意義[3]。該研究應用實時熒光定量PCR方法檢測KRAS、NRAS和 BRAF基因在CRC中的突變率，并分析其與CRC病理特征、患者吸煙和飲酒情況的相關性，明確中國人群KRAS、NRAS和 BRAF基因的突變特征，指導臨床CRC的個體化治療，為選擇合適的臨床治療方案提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1臨床標本和資料收集鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院分子病理科2014年3月至6月確診為CRC的242患者的甲醛固定的石蠟包埋組織。其中242例檢測KRAS基因第2號外顯子的12密碼子和13密碼子7個突變位點，237例檢測NRAS基因 2號外顯子和3號外顯子的12、13和61密碼子12個突變位點，237例檢測BRAF 基因15號外顯子V600E位點突變。查閱臨床病例資料，收集患者的性別、年齡、病理診斷、吸煙和飲酒史。在收集病理特征時，部分病例數(shù)據(jù)缺失，在做相應基因突變與病理特征相關性分析時，去除缺失病例，只保留有效數(shù)據(jù)。

1.2標本處理及檢測方法每例標本取3～5 μm厚的10卷石蠟組織，用二甲苯脫蠟，乙醇洗脫二甲苯后金屬浴100 ℃烘干。采用TIANGEN 石蠟包埋組織DNA提取試劑盒提取DNA。用NANO DROP 2000測定所提取的DNA濃度，調(diào)整最適質(zhì)量濃度為20 μg/ L，OD(450)值1.8～2.0。采用實時熒光定量PCR方法檢測基因突變， KRAS、NRAS和 BRAF 基因突變檢測試劑盒購于北京雅康博公司。

1.3統(tǒng)計學處理采用SPSS 20.0進行分析，應用χ2檢驗或Fisher精確概率法比較KRAS、NRAS和BRAF 基因突變率在不同年齡段、性別、腫瘤部位、組織學類型、分化程度、遠處轉(zhuǎn)移、淋巴結轉(zhuǎn)移、癌結節(jié)、AJCC分期和Duke′S分期等病理特征和吸煙、飲酒是否存在統(tǒng)計學差異，檢驗水準取α=0.05。

2結果

2.1CRC患者KRAS 、NRAS和BRAF基因突變與病理特征之間的關系見表1。242例CRC標本做了KRAS基因突變檢測檢測，其中突變型93例，野生型149 例，突變率為38.0%。237例CRC標本做了NRAS 基因突變檢測，其中突變型12例，野生型225例，突變率為5.0%。237例CRC標本做了BRAF 基因突變檢測檢，其中突變型5例，野生型232例，突變率為2.1%。

表1　CRC患者KRAS、NRAS和BRAF基因突變與病理特征之間的關系

*：Fisher精確概率法。

2.2KRAS基因野生型中NRAS與BRAF基因的突變率在149例KRAS基因野生型病例中共147例分別做了NRAS與BRAF基因突變檢測，其中10例NRAS基因突變，突變率為6.8%，5例BRAF基因突變，突變率為3.4%，在KRAS基因野生型病例中NRAS與BRAF基因突變率與病理特征之間沒有相關性(P>0.05)。

2.3CRC患者KRAS、NRAS 和BRAF基因突變與吸煙和飲酒的關系見表2。

表2　CRC患者KRAS、NRAS和BRAF基因突變與吸煙、飲酒之間的關系

*：Fisher精確概率法。

3討論

在CRC中常見的突變位點位于2號外顯子的12密碼子與13密碼子，突變率為30%～40%。該研究共檢測了242例患者，KRAS基因突變率為38%，突變更傾向于發(fā)生Duke′S分期的C期和淋巴結有轉(zhuǎn)移的患者，與其他病理特征之間沒有明顯的相關性。高靜等[4]報道966例中國CRC患者KRAS基因突變率為38.8%，與該研究結果一致，并且認為KRAS基因在女性腫瘤分化程度好的右邊結腸的突變率高，且與患者的年齡也有關。另外有研究[5]報道，KRAS基因突變率為40.4%，突變更易發(fā)生于女性患者，與其他病理特征無相關性。

有研究[6-7]已經(jīng)證明攜帶有KRAS基因突變的CRC患者對抗EGFR治療無效，然而并不是所有攜帶KRAS基因野生型患者都能夠從抗EGFR治療中受益，仍有40%～60%的KRAS基因野生型患者對抗EGFR治療無效[8]，在EGFR下游的RAS-RAF-MAPK和 PI3K-AKT-mTOR的信號通路中存在NRAS、BRAF、PIK3CA和PTEN等一些其他突變基因。NRAS基因與KRAS基因一樣同屬于RAS家族，在國外的研究[9]報道中NRAS基因在CRC中的突變率為2.7%，突變頻率在遠端結直腸癌較高。而在Irahara等[10]的報道中NRAS的突變率2.2%，突變較易發(fā)生在女性患者的左半結直腸。該研究結果顯示NRAS的突變率為5%，高于國外突變率；在KRAS野生型基因中NRAS突變率為6.8%，說明即使CRC患者檢測KRAS基因為野生型，仍有6.8%的概率由于NRAS的突變而表現(xiàn)出對靶向治療無效。BRAF基因在多種癌組織存在突變，最常發(fā)生于黑色素瘤、甲狀腺癌和CRC，BRAF基因在CRC中的突變往往與不良的預后有關[11]。高靜等[4]報道966例BRAF基因突變中，BRAF突變率為4.4%，在分化程度差和右半結腸中突變率高，與其他病理特征沒有相關性。Kadowaki等[12]報道811例腫瘤患者中BRAF基因的突變率為5%，在近端結直腸、黏液癌和分化差的組織中突變率高。該研究結果顯示BRAF基因突變率為2.1%，在KRAS野生型基因中的突變率為3.4%，與病理特征沒有相關性，并且BRAF基因與 KRAS和NRAS基因突變相互排斥。BRAF基因突變率均低于國內(nèi)外報道，可能與該研究的樣本量小有一定的關系。

國內(nèi)外關于KRAS、NRAS和 BRAF基因在CRC中突變狀態(tài)與病理特征之間關系的研究結果各有差異，這可能與檢測方法、樣本量和地區(qū)差異有關[4-5,7,13]。目前在國內(nèi)關于NRAS基因在結直腸癌中的突變率的研究缺乏大樣本量的研究，該研究中NRAS基因突變率為5.0%，明顯高于國外，因此在行抗EGFR治療前，有必要把 NRAS基因列入常規(guī)基因檢測。雖然現(xiàn)在仍無證據(jù)表明可以根據(jù)BRAF的突變狀態(tài)使用抗EGFR治療，但有研究[4,12]顯示BRAF突變伴有一些高危的臨床病理特征，與近端CRC、分化差、T4期腫瘤有關，在 2015年的NCCN臨床實踐指南中推薦診斷為Ⅳ期的CRC患者行BRAF的突變檢測。

該研究同時分析了CRC患者KRAS、NRAS和 BRAF基因突變與吸煙和飲酒之間的關系，未發(fā)現(xiàn)它們之間存在關聯(lián)性，提示CRC患者KRAS 、NRAS 和BRAF基因的突變率可能不受吸煙與飲酒因素的影響，但該結論是否受樣本量與質(zhì)量的限制，仍需有待進一步去驗證。

參考文獻

[1]宗星月,李進偉.針對EGFR和VEGF/VEGFR靶點的腫瘤分子靶向藥物研究進展[J].中國實用內(nèi)科雜志,2014,34(S2):62

[2]LI W,QIU T,LING Y,et al.Molecular pathological epidemiology of colorectal cancer in Chinese patients with KRAS and BRAF mutations[J].Oncotarget,2015,6(37):39607

[3]MA BB,MO F,TONG JH,et al.Elucidating the prognostic significance of KRAS, NRAS, BRAF and PIK3CA mutations in Chinese patients with metastatic colorectal cancer[J].Asia Pac J Clin Oncol,2015,11(2):160

[4]高靜,孫志偉,李艷艷,等.中國結直腸癌患者966例中KRAS和BRAF基因突變分析[J].中華病理學雜志,2012,41(9):579

[5]ZHU XL, CAI X, ZHANG L, et al. KRAS and BRAF gene mutations in correlation with clinicopathologic features of colorectal carcinoma in Chinese[J]. Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi,2012,41(9): 584

[6]KNICKELBEIN K,ZHANG L.Mutant KRAS as a critical determinant of the therapeutic response of colorectal cancer[J].Genes Dis,2015,2(1):4

[7]KAWAZOE A,SHITARA K,FUKUOKA S,et al.A retrospective observational study of clinicopathological features of KRAS, NRAS, BRAF and PIK3CA mutations in Japanese patients with metastatic colorectal cancer[J].BMC Cancer,2015,15(1):258

[8]LI Z,LIU XW,CHI ZC,et al.Detection of K-ras mutations in predicting efficacy of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase (EGFR-TK) inhibitor in patients with metastatic colorectal cancer[J].PLoS One,2015,10(5):e0101019

[9]OGURA T,KAKUTA M,YATSUOKA T,et al.Clinicopathological characteristics and prognostic impact of colorectal cancers with NRAS mutations[J].Oncol Rep,2014,32(1):50

[10]IRAHARA N,BABA Y,NOSHO K,et al.NRAS mutations are rare in colorectal cancer[J].Diagn Mol Pathol,2010,19(3):157

[12]KADOWAKI S,KAKUTA M,TAKAHASHI S,et al.Prognostic value of KRAS and BRAF mutations in curatively resected colorectal cancer[J].World J Gastroenterol,2015,21(4):1275

[13]趙恒飛.KRAS基因第12、13位密碼子突變型大腸癌患者的臨床病理特征、靶向治療療效及生存分析[D].長春:吉林大學,2014.

(2015-05-15收稿責任編輯趙秋民)

Relationship between KRAS,NRAS and BRAF gene mutation and pathological features,smoking and drinking of patients with colorectal cancer

WUXinxin,MAJie,RENPengfei,GUOXiaoxuan,GUOYongjun

DepartmentofMolecularPathology，theAffiliatedTumorHospital,ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450003

Key wordscolorectal cancer;gene mutation;pathological characteristic;KRAS;NRAS;BRAF;smoking;drinking

中圖分類號R734.34

通信作者#，男，1963年6月生，博士，研究員，研究方向：分子病理，E-mail:yongjunguo@hotmail.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.010