靶向PD-L1基因的CRISPR/Cas9基因敲除質粒的構建*

孫冉冉，陳曉龍，李　娟，申　申，李晶晶，闞全程，余祖江#

1)鄭州大學第一附屬醫院感染科 鄭州 450052　2)鄭州大學第一附屬醫院藥學部 鄭州 450052

?

靶向PD-L1基因的CRISPR/Cas9基因敲除質粒的構建*

孫冉冉1)，陳曉龍1)，李娟1)，申申1)，李晶晶1)，闞全程2)，余祖江1)#

1)鄭州大學第一附屬醫院感染科 鄭州 4500522)鄭州大學第一附屬醫院藥學部 鄭州 450052

關鍵詞PD-L1；腫瘤免疫；CRISPR/Cas9；基因敲除

摘要目的：構建靶向PD-L1基因的CRISPR/Cas9基因敲除質粒。方法：根據CRISPR/Cas9靶點設計原則，設計并合成靶向PD-L1基因的5對sgRNA序列。為了進一步降低克隆背景和提高構建陽性率，在受體載體中引入毒性蛋白系統(Ccd)。構建pX459-CcdB重組載體，將pX459-CcdB載體進行BbsⅠ酶切，將sgRNA插入到pX459-CcdB骨架載體中，轉化到不含CcdA基因的宿主菌Stbl3中。酶切不完全引起的背景載體將因毒性蛋白的作用殺死宿主菌。轉化后挑取陽性克隆，進行PCR和測序驗證。結果與結論：經PCR和測序驗證，重組質粒pX459-PD-L1-sgRNA構建成功，為下一步體內外敲除PD-L1基因和深入研究其在腫瘤免疫逃逸中的功能奠定了基礎。

AbstractAim: To construct CRISPR/Cas9 gene knock-out plasmid targeting PD-L1 gene.Methods: According to the principle of CRISPR/Cas9 sgRNA design,five sgRNA sequences targeting PD-L1 gene were selected. To reduce the undesirable cloning background and increase the positive rate,the control of cell division or death system(Ccd) was introduced to the receptor vector.Firstly the CcdB gene was cloned into the pX459 plasmid to obtain the pX459-CcdB recombinant vector,which was then digested by BbsⅠ.Afterwards,the sgRNA was inserted into the pX459-CcdB and transformed into Stbl3 without CcdA gene,then the undesirable cloning background caused by incomplete digestion would kill host bacteria via the action of toxic proteins.Finally,the single clone was picked up and identified with PCR and senquncing.Results and Conclusion: pX459-PD-L1-sgRNA has been successfully constructed and confirmed by PCR and sequencing.It will be helpful for knocking PD-L1 gene in vitro and vivo and further exploring the role of PD-L1 in tumor immune escape.

近年來研究[1]表明，介導協同刺激信號的協同刺激分子構成了腫瘤微環境的重要成分，已成為免疫學研究新的熱點之一，其中的重要成員程序性死亡分子1配體-1(programmed death-1 ligand-1，PD-L1 )和其受體PD-1組成了重要的免疫檢查點通路之一。研究[2-4]發現PD-L1在腫瘤的免疫逃逸過程中發揮了重要作用，幾乎所有的實體腫瘤例如肝癌、乳腺癌、腎癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、黑色素瘤等人類惡性腫瘤組織中均可以檢測到PD-L1的表達，其可通過抑制腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)的活化并誘導其凋亡而抑制機體的抗腫瘤免疫，導致腫瘤免疫逃逸的發生。因此，阻斷PD-1/PD-L1通路成為腫瘤免疫治療的新途徑。近年來靶向PD-1/PD-L1的單克隆抗體藥物的研發已經成為各大藥物研發公司的重點突破對象，并且在黑色素瘤和非小細胞肺癌患者的臨床試驗中已經取得了突破性的進展[5]。

CRISPR/Cas9技術是一種可以對人類基因組進行高效、精確地定點修飾的新基因工程技術。CRISPR/Cas9系統通過靶標序列對應的RNA序列與外源DNA互補，引導Cas9內切酶對互補的靶序列進行雙鏈切割，從而對基因進行修飾；其具有技術簡單、價格低廉、操作快捷的特點；同時Cas9結構功能域的功能改造使得CRISPR/Cas9技術在基因編輯領域的應用日漸廣泛[6-7]。

因此，作者構建了靶向PD-L1基因的CRISPR/Cas9基因敲除質粒。在質粒構建過程中，為了進一步降低克隆背景和提高構建陽性率，在受體載體中引入毒性蛋白系統(control of cell division or death system,Ccd)進行篩選。該質粒可以在腫瘤細胞和動物模型中敲除PD-L1基因，為進一步研究PD-L1基因在腫瘤發生、發展中的作用奠定基礎。

1材料與方法

1.1主要試劑和菌株感受態大腸桿菌Stbl3、感受態大腸桿菌DB3.1購自上海士鋒生物技術公司；CRISPR/Cas9質粒骨架pX459購自美國Addgene公司；Gateway cloning system購自美國Invitrogen公司；T4 DNA連接酶、FastAP 去磷酸化酶購自美國Fermentas公司；限制性內切酶BbsⅠ、T4 PNK激酶購自美國NEB公司；DNA marker購自TaKaRa公司；質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、DNA純化試劑盒購自美國Omega Bio-Tek公司；其余化學試劑購自上海生工生物工程有限公司。

1.2靶向PD-L1基因的gRNA的設計和選擇根據CRISPR/Cas9靶點設計原則，利用gRNA在線設計工具(http://crispr.mit.edu)篩選并進行脫靶效應評估，從中挑選出特性強的gRNA。gRNA設計的主要原則如下：3’端有NGG堿基序列的20個連續的堿基序列，其中PAM序列不在20個連續的堿基序列范圍之內；必須在外顯子區域，盡量選擇靠前的外顯子，造成移碼突變的概率較大；利用生物信息學軟件進行全基因組比對，避免脫靶風險大的靶點序列，同時考慮到gRNA的效率和由于染色體和核小體的三維結構可能造成的空間位阻效應導致的Cas9無法結合的情況。同時選擇以下5個序列作為構建靶向PD-L1基因的靶點序列(圖1)，通過體外實驗，從中篩選出效率較高的gRNA，以增加成功率和增強敲除效率。

圖1　靶向PD-L1基因靶點位置示意圖

1.3引物合成根據實驗要求設計用于構建pX459-CcdB和靶向PD-L1基因的sgRNA(PD-L1-sgRNA)引物 (表1)，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1　引物序列

1.4質粒pX459-CcdB的構建

1.4.1構建過程整個質粒構建過程見圖2。

圖2　載體pX459-CcdB構建過程示意圖

1.4.2CcdB基因的擴增根據設計合成的引物，從gateway系統中擴增CcdB基因并引入BbsⅠ酶切位點。PCR體系包括PCR buffer 4 μL、dNTPs 2 μL、gateway vector 2 PCR 0.2 μL、5 u/μL的 Go Taq Polymerase 0.1 μL、CcdB上下游引物各2 μL，雙蒸水定容至20 μL。反應條件為95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃120 s，30個循環。PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，按照膠回收試劑盒操作說明對目的片段進行膠回收。取1 μL回收產物、1 μLBbsⅠ酶、5 μL NEB3.1 buffer用ddH2O定容至50 μL，建立酶切體系，于37 ℃水浴鍋中酶切1 h。酶切產物按DNA純化試劑盒操作說明進行過柱回收。

1.4.3目的片段與載體片段的連接參照1.4.2中的酶切體系將pX459進行BbsⅠ酶切和膠回收，用T4 DNA連接酶將回收的載體片段與CcdB基因PCR產物進行連接。目的片段與載體片段物質的量之比為3～10。連接體系：CcdB 產物50 ng，pX459載體100 ng，T4 buffer 2 μL，T4 DNA連接酶1 μL，用ddH2O定容至20 μL。于16 ℃水浴連接過夜。

1.4.4pX459-CcdB的驗證連接產物轉化DB3.1感受態細胞，LB培養基37 ℃培養過夜。第2天，從LB平板上挑選出生長狀況良好的單菌落置于5 mL含有所需抗性(Amp+Chl+)的LB培養液中，37 ℃ 250 r/min 培養過夜。第3天進行菌液PCR驗證,若符合預期，則取100 μL菌液送上海生工生物工程有限公司測序。若測序正確，則按質粒提取試劑盒說明書操作，提取質粒pX459-CcdB。

1.5載體pX459-PD-L1-sgRNA的構建用內切酶BbsⅠ酶切pX459-CcdB，膠回收骨架大片段，去除CcdB片段，測定濃度待用。反應體系：5對sgRNA上下游引物(用雙蒸水稀釋)各2 μL，10×T4 buffer 5 μL，T4 PNK 1 μL，ddH2O定容至50 μL。首先37 ℃反應30 min進行激酶處理，隨后置于沸水浴中3 min，待冷卻至室溫后，將sgRNA退火產物與骨架大片段用T4 DNA連接酶進行連接，連接體系參考1.4.3，于16 ℃水浴連接過夜。連接產物用Stbl3感受態細胞轉化，LB培養基37 ℃培養過夜。第2天，從LB平板上挑選生長狀況良好的單菌落置于5 mL含有所需抗性(Amp+)的LB培養液中，37 ℃ 250 r/min培養過夜。第3天用菌液PCR法篩選克隆，若利用U6啟動子通用上游引物及sgRNA下游引物在篩選的陽性菌液中擴增到與目的基因片段大小一致的陽性條帶，則為陽性。取陽性菌液送上海生工生物工程有限公司進行測序。

2結果

2.1pX459-CcdB的酶切鑒定PCR結果見圖3。

M:Marker；左1：pX459；左2：經BbsⅠ酶切的pX459；右1：pX459-CcdB；右2：經BbsⅠ酶切的pX459-CcdB。圖3　pX459(左)及pX459-CcdB(右)酶切結果

2.2pX459-PD-L1-sgRNA的PCR鑒定經PCR擴增，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確，結果見圖4。

M：Marker；1：用U6和PD-L1-sgRNA下游引物擴增；2：只用U6引物擴增；3：只用PD-L1-sgRNA下游引物擴增。圖4　pX459-PD-L1-sgRNA PCR鑒定結果

2.3pX459-PD-L1-sgRNA的測序測序比對結果見圖5。圖5說明，重組載體中插入的序列與sgRNA序列一致，載體構建成功。

圖5　pX459-PD-L1-sgRNA測序鑒定結果

3討論

腫瘤的發生、發展不僅僅取決于腫瘤細胞本身的特性，而且還取決于腫瘤細胞賴以生存的土壤，即腫瘤微環境[8]。腫瘤細胞周圍的免疫微環境(包括免疫細胞和免疫因子)參與了腫瘤的進展過程，與腫瘤的發生、發展和預后密切相關，其中介導協同刺激信號的協同刺激分子構成了腫瘤微環境的重要成分，而近年來研究[9]表明負性協同刺激分子的重要成員PD-L1/PD-1免疫檢查點通路在腫瘤的發生、發展和免疫逃逸機制中發揮了重要作用，有望成為新的治療靶點。

CRISPR系統最早發現于細菌和古生菌中，該系統由成簇間隔的短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindrome repeat sequences)和Cas基因(CRISPR-associated genes)組成，被認為是細菌的適應性免疫系統[10]。2013年研究者將CRISPR/Cas系統進行改造并成功應用到真核生物的基因編輯，利用人工合成的crRNA序列可以使Cas9 系統識別并結合到與該crRNA互補的DNA 序列上，介導Cas9 蛋白特異性切割該靶位點。Cas9 蛋白帶有核定位信號(nuclear localization signal，NLS)，使其能夠與sgRNA結合并組裝成sgRNA-Cas9 復合體，在目標基因PAM(proto spacer adjacent motif)元件的上游使DNA雙鏈斷裂；DNA發生雙鏈斷裂后，細胞利用自身的易錯傾向的非同源末端連接(non-homologous end joining， NHEJ)修復，同源修復的過程中會在斷裂位點發生插入或缺失，繼而發生移碼突變，最終實現對目標基因組的改造[7]。該系統可對任何靶位點后緊隨的NGG(PAM)的17～20 bp序列進行定點編輯。由于人類基因組中存在豐富的NGG序列，因此利用該系統幾乎可以對人類基因的任何位置進行編輯[11]。同現有的基因編輯工具鋅指核酸酶(ZFNs)和TALE核酸酶(TALENs)相比，CRISPR/Cas 系統載體構建簡單，只需設計并改造載體上目的基因的sgRNA序列即可[12]。傳統的siRNA和shRNA基因沉默技術都是RNA干擾技術，其結構是與內源性mRNA編碼區同源的雙鏈RNA，其通過阻礙特定基因的翻譯或轉錄來抑制基因表達，當細胞中導入siRNA或shRNA時，靶向mRNA發生降解，繼而導致基因沉默[13]。siRNA只是對靶基因進行一過性的沉默，隨著siRNA的降解，基因沉默作用也隨之消失；而shRNA雖然能夠通過整合到目標基因組中，從而對靶基因進行持續的抑制，但是其載體必須是病毒載體，構建費用較高，同時病毒整合對目標細胞會造成一定的影響[14]。而CRISPR/Cas9是從基因水平將靶基因徹底、永久地敲除，因此更具優勢。這些明顯的優勢使該技術為人類醫學、動物研究以及植物的改良育種等各方面的研究提供了高效武器，極有希望用于人體的基因治療[15-16]。

該實驗中，作者首先設計出可使目標DNA雙鏈發生斷裂的sgRNA-Cas9體系，利用Addgene公司提供的pX459質粒骨架系統，將設計好的、能夠結合靶基因的sgRNA序列經過酶切后連入該載體中。在載體構建過程中，為了進一步降低克隆背景和提高構建陽性率，在受體載體中引入Ccd進行篩選。最后，作者成功構建了靶向PD-L1基因的CRISPR/Cas9基因敲除質粒，為下一步體內外水平敲除PD-L1基因、進一步研究其在腫瘤進展過程中的作用打下了良好的基礎。

參考文獻

[1]IWAI Y,ISHIDA M,TANAKA Y,et al.Involvement of PD-L1 on tumor cells in the escape from host immune system and tumor immunotherapy by PD-L1 blockade[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2002,99(19):12293

[2]DONG H,STROME SE,SALOMAO DR,et al.Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion[J].Nat Med,2002,8(8):793

[3]THOMPSON RH,KUNTZ SM,LEIBOVICH BC,et al.Tumor B7-H1 is associated with poor prognosis in renal cell carcinoma patients with long-term follow-up[J].Cancer Res,2006,66(7):3381

[4]GAO Q,WANG XY,QIU SJ,et al.Overexpression of PD-L1 significantly associates with tumor aggressiveness and postoperative recurrence in human hepatocellular carcinoma[J].Clin Cancer Res,2009,15(3):971

[5]OHAEGBULAM KC,ASSAL A,LAZAR-MOLNAR E,et al.Human cancer immunotherapy with antibodies to the PD-1 and PD-L1 pathway[J].Trends Mol Med,2015,21(1):24

[6]COX DB,PLATT RJ,ZHANG F.Therapeutic genome editing: prospects and challenges[J].Nat Med,2015,21(2):121

[7]CONG L,RAN FA,COX D,et al.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J].Science,2013,339(6121):819

[8]HANAHAN D,WEINBERG RA.Hallmarks of cancer:the next generation[J].Cell,2011,144(5):646

[9]RIBAS A,TUMEH PC.The future of cancer therapy:selecting patients likely to respond to PD1/L1 blockade[J].Clin Cancer Res,2014,20(19):4982

[10]BARRANGOU R,FREMAUX C,DEVEAU H,et al.CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes[J].Science,2007,315(5819):1709

[11]WANG HY,YANG H,SHIVALILA CS,et al.One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering[J].Cell,2013,153(4):910

[12]GUIMOND S,CHATARD A,MARTINOT D,et al.Social comparison,self-stereotyping,and gender differences in self-construals[J].J Pers Soc Psychol,2006,90(2):221

[13]PENNISI E.The CRISPR craze[J].Science,2013,341(6148):833

[14]LU XJ,XUE HY,KE ZP,et al.CRISPR-Cas9:a new and promising player in gene therapy[J].J Med Genet,2015,52(5):289

[15]HAUSSECKER D,KAY MA.RNA interference:drugging RNAi[J].Science,2015,347(6226):1069

[16]RAO DD,VORHIES JS,SENZER N,et al.siRNA vs.shRNA:similarities and differences[J].Adv Drug Deliv Rev,2009,61(9):746

Construction of CRISPR/Cas9 gene knock-out plasmid targeting PD-L1 gene

SUNRanran1)，CHENXiaolong1)，LIJuan1)，SHENShen1)，LIJingjing1)，KANQuancheng2)，YUZujiang1)

1)DepartmentofInfectionDisease，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou4500522)DepartmentofPharmacology，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

Key wordsPD-L1；tumor immunity；CRISPR/Cas9；gene knock-out

中圖分類號Q781

通信作者#，男，1971年5月生，教授，研究方向：重癥肝炎和肝癌的綜合治療，E-mail:johnyuem@zzu.edu.cn

基金項目*河南省科技廳創新人才124100510010；鄭州大學第一附屬醫院青年 (2013年)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.006