PCR-DGGE技術在廢水生物處理中的應用

武振興

(秦皇島經濟技術開發(fā)區(qū)環(huán)境監(jiān)察大隊, 河北 秦皇島 066000)

?

PCR-DGGE技術在廢水生物處理中的應用

武振興

(秦皇島經濟技術開發(fā)區(qū)環(huán)境監(jiān)察大隊, 河北 秦皇島 066000)

摘要：變性梯度凝膠電泳( PCR- DGGE)具有可靠性強、重復性好、方便快捷等優(yōu)點，目前被廣泛地應用于廢水生物處理環(huán)境微生物群落多樣性和動態(tài)分析。本文對PCR- DGGE技術的基本原理和流程，圖譜的優(yōu)化過程和圖譜分析方法，及其在環(huán)境微生物生態(tài)學中的應用進行了綜述，并對該技術自身存在的局限性和應用前景進行了評價。

關鍵詞：PCR；DGGE；微生物分析

1PCR-DGGE基本原理與方法

1.1PCR-DGGE的基本原理

DNA分子雙螺旋結構是由氫鍵和堿基的疏水作用共同作用的結果。溫度、有機溶劑和pH等因素可以使氫鍵受到破壞，導致雙鏈變性為單鏈。DGGE技術檢測核酸序列是通過不同序列DNA片段在各自相應的變性劑濃度下變性，發(fā)生空間構型的變化，導致電泳速度的急劇下降,最后在其相應的變性劑梯度位置停滯，經過染色后可以在凝膠上呈現為分散的條帶。該技術可以分辨具有相同或相近分子量的目的片段序列差異，可以用于檢測單一堿基的變化和遺傳多樣性以及PCR擴增DNA片段的多態(tài)性[1]。該技術首先從復雜微型生物集合中提取基因組DNA，用特異性引物(如16SrRNA基因和18SrRNA基因)進行PCR擴增，混合的PCR產物在變性劑線性梯度變化的聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，相同大小不同序列的DNA 片段將停留在凝膠的不同位置，以達到分離混合PCR產物的目的。

1.2PCR-DGGE的流程

PCR-DGGE的基本流程是(1)首先從各種不同環(huán)境中取得環(huán)境樣品；(2)進行環(huán)境樣品宏基因組DNA的提取及純化；(3)通過聚合酶連鎖反應PCR將提取的宏基因組DNA中的特定序列如16SrDNA和18SrDNA進行擴增；(4)進行預實驗，優(yōu)化DGGE條件；(5)制膠；(6)擴增產物利用DGGE進行分離；(7)DGGE圖譜分析；(8)對DGGE條帶進行測序并鑒定分析；(9)鑒定群落成員。

2PCR-DGGE技術在廢水生物處理中的應用

PCR-DGGE技術解決了傳統(tǒng)方法的片面性，在分析各種環(huán)境微型生物群落多樣性和動態(tài)性方面得到了廣泛應用。于水利等，利用PCR-DGGE方法對3個不同碳源供應的反應器內細菌多樣性進行分析，發(fā)現以污水為碳源的反應器內細菌多樣性要優(yōu)于葡萄糖碳源和乙酸鈉碳源的反應器[2]。張丹等采用變性梯度凝膠電泳檢測技術對硝化菌群的的特異性擴增產物進行了分析，發(fā)現限氧自氧硝化一反硝化生物脫氮系統(tǒng)中氨氧化菌和亞硝酸氧化菌隨溶解氧的降低表現出了不同的種群變化規(guī)律，氨氧化菌種群多樣性受溶解氧的影響非常大，而亞硝酸氧化菌的種群多樣性比較單一，且不受溶解氧的影響[3]。

陳桐生等，以PCR技術擴增基因的V3可變區(qū)，結合應用雙梯度變性梯度凝膠電泳這一技術，分析除臭生物濾池中不同空間層次的微生物種群的基因多樣性，及富集前后微生物種群結構的變化，以期了解可培養(yǎng)細菌的情況，對主要片段進行序列分析。發(fā)現在濾池的不同層次上呈現出明顯的空間分布多樣性差異，并且培養(yǎng)前后及不同培養(yǎng)基富集。培養(yǎng)的微生物種群的多樣性及特異性有很大的差別。序列比對顯示，硫氧化細菌在除臭過程中占有優(yōu)勢地位[4]。

王曉丹等在對北京翠湖濕地污水塘、 表流濕地和潛流濕地3 個單元的PCRDGGE分析中發(fā)現，北京翠湖表流和潛流濕地改變了水體中總的微生物數量及可培養(yǎng)的細菌數量，隨著濕地單元的逐級處理,總的微生物數量呈逐漸上升趨勢，且表流和潛流濕地處理改變了水體中細菌的優(yōu)勢群落結構，發(fā)現了某些可能對水質造成危害的類群[5]。

Moura等采用16S rDNA的DGGE技術，分析了2個污水處理廠曝氣池中微生物菌群的變化，DGGE圖譜顯示，在春冬和夏秋季節(jié)收集的樣品中，微生物的變化很大，溫度、 pH、 溶解氧(DO)等因素均能影響微生物群落的結構，并進一步確定了所研究樣品中的主要微生物種群[6]。孫寶盛等在實際工程中比較了用膜生物反應器( MBR)處理不同水質后微生物的DGGE 圖譜，分析了不同MBR中微生物群落多樣性的特點，結果表明，不同水質條件的MBR 在長期穩(wěn)定運行后，形成了各自特定的生態(tài)群落結構，既有共同的優(yōu)勢種群，也有因水質的不同經過長期演替而產生的各自的種群[7]。張洪軍等在研究A/ O工藝膜生物反應器處理生活污水的脫氮特性時，采用了PCR-DGGE技術,發(fā)現隨著系統(tǒng)時間的延長，硝化細菌的數量逐漸增加，并且不同菌種的豐度也發(fā)生了變化[8]。

荷蘭Delft大學Sliekers等[9]應用分子生物技術發(fā)現CANON工藝中可能存在三種微生物：類亞硝化單胞菌的好氧氨氧化菌、類浮霉狀菌的厭氧氨氧化菌以及氧化亞硝酸鹽的硝化菌和硝化螺菌，并分析了它們在系統(tǒng)中的相互反應與競爭關系。Egli等[10]人則分析了生物膜CANON工藝的生物構成和基質代謝的途徑。董遠湘[11]等人用PCR-DGGE技術對OLAND中硝化階段不同時期的生物膜中微生物的種群動態(tài)變化進行了分析。研究表明，群落結構和優(yōu)勢種群的數量具有時序動態(tài)性，微生物多樣性與廢水的處理效果出現協(xié)同變化的特征。測序結果表明，在生物膜中進行氨氧化作用的主要為亞硝化桿菌(Nitrosomonas sp.)、亞硝化螺菌(Nitrosospira sp.)；進行亞硝酸氧化的主要為硝化球菌(Nitrococcus sp.)。

3PCR-DGGE方法的局限性

DGGE技術具有以下缺陷: 1) 其檢測的DNA片段最適長度為500bp，超出此范圍的片段 DGGE分辨率會下降；2) PCR 擴增所需GC堿基對含量至少達40bp；3)如果電泳的條件不適宜，不能保證將有一定序列差異的DNA片段完全分開，會出現序列不同的DNA遷移在同一位置的現象。DGGE的條帶數不能完全精確地反映被分析的混合物中不同序列的數量。有時一條DGGE帶可能代表幾種物種，從而導致自然群落中生物的數量被低估，或者可能不同的幾條DGGE帶代表同一物種，從而導致高估自然群落中生物的數量；4)數量較少的物種DNA 可能得不到PCR擴增。

PCR技術本身也存在不足， 1992年Reysenbach發(fā)現用rDNA基因在PCR過程中會產生優(yōu)先擴增現象，只擴增部分細菌的DNA，造成了群落中原始成員的減少。另一個問題就是嵌合體的形成或異源雙鏈的產生。它會影響DGGE圖譜中條帶的分布。DGGE只能分離較小的片段(1 kb 以下)，較長的片段分離率下降，這就限制了系統(tǒng)發(fā)育分析和探針的序列信息量。其次，若選用的條件不是特別適宜，DGGE并不能保證可以將有一定序列差異的 DNA 片段完全分開，可能會出現不同序列DNA的共遷移現象。再者，有些細菌具有多操縱子，使同一種菌的DGGE圖譜上出現多條帶，從而高估了樣品中微生物的多樣性。

4結論及展望

以 PCR-DGGE 為代表的現代分子生物學的發(fā)展為廢水生物處理新工藝中的微生態(tài)與微生物特性提供了強有力的方法和手段。通過檢測廢水生物處理中微生物種群DNA序列多態(tài)性、鑒定個體基因，就可以在基因水平上評價種群的遺傳分化，并在分子水平上闡述分子適應等生態(tài)問題的機制，這對更好地揭示廢水生物處理新技術中微生物與環(huán)境之間的生態(tài)學關系以及為實現新型脫氮工藝系統(tǒng)的優(yōu)化運行具有深刻的理論研究意義與實際應用價值。

參考文獻:

[1]宮曼麗, 任南琪, 邢德峰. DGGE / TGGE 技術及其在微生物分子生 態(tài)學 中的 應用[J]. 微生 物學 報, 2004, 44 ( 6 ) :845 848.

[2]Yu Shuili,Liu Yanan,Jing Guolin,et al. Analysis of phosphate-accumulating organisms cultivated under different carbon sources with polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis assay.Journal of Enviromental Sciences,2005,17:611-614.

[3]Zhang Dan,Zhang Demin,Liu Yaoping,et.al.Community analysis of ammonia oxidizer in the oxygen2 limited nitritation stage of OLAND system by DGGE of PCR amplified 16s rDNA fragments and FISH.Joural of Enviromental Sciences,2004,16:838-842.

[4]陳桐生，李建軍，齊英華，等.不同PH條件小除臭生物濾池微生物種群結構的分子生態(tài)分析.微生物學報,2005,15:446-450.

[5]王曉丹, 翟振華, 趙爽, 等. 北京翠湖表流和潛流濕地對細菌多樣性的影響[J].環(huán)境科學, 2009, 30( 1) : 280288.

[6]Moura A, T acao M, Henriques I, et al. Characterization of bacterial diversity in two aerated lagoons of a waste water treatment plant using PCR-DGGE analysis[J]. Microbiological Research, 2009, 164( 5) : 560 -569.

[7]孫寶盛, 張斌, 吳卿, 等. 應用PCR-DGGE技術解析 MBR中微生物群落多樣性[J]. 天津大學學報, 2008, 41 ( 3 ) : 356-361.

[8]張洪軍, 朱彤. A/O工藝膜生物反應器處理生活污水的脫氮特性及硝化菌群的分子檢測[J]. 環(huán)境污染與防治, 2009,31( 1) : 47-50.

[9]Third KA, Sliekers AO, Kuenen JG, et al .The CANON System (Completely Autotrophic Nitrogen-removal Over Nitrite) under Ammonium Limitation: Interaction and Competition between Three Groups of Bacteria[J].System. Appl. Microbiol, 2001，24(4):588-596.

[10]Egli K, et al. Microbial composition and structure of a rotating biological contactor biofilm treating ammonium-rich wastewater without organic carbon[J].Microb Ecol, 2003，45:419-432.

[11]董遠湘，李小明，尹疆，楊麒，鐘瓊.溶解氧對OLAND 生物膜反應器硝化性能的影響及其微生物種群動態(tài)研究[J].環(huán)境污染與防治，2005，27(8):561-564.

中圖分類號:X830

文獻標志碼：A

文章編號：1671-1602(2016)08-0022-02

作者簡介：武振興(1983-)，男，漢，秦皇島撫寧縣，工程師，本科，單位：秦皇島經濟技術開發(fā)區(qū)環(huán)境監(jiān)察大隊，研究方向：環(huán)境保護。