攜帶blaCTX-M-65、rmtB和fosA3多重耐藥質粒pHN7A8的適應性研究

何良英，劉蘭平，曾振靈，劉健華

(華南農業大學獸醫學院，廣州510642)

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攜帶blaCTX-M-65、rmtB和fosA3多重耐藥質粒pHN7A8的適應性研究

何良英#，劉蘭平#，曾振靈，劉健華*

(華南農業大學獸醫學院，廣州510642)

摘要：為分析攜帶blaCTX-M-65、rmtB和fosA3多重耐藥質粒pHN7A8的適應性代價，將犬源大腸桿菌7A8的多重耐藥質粒pHN7A8轉化入大腸桿菌JM109中，獲得轉化子7A8JT，并采用生長曲線測定和競爭試驗方法研究pHN7A8對宿主菌適應性的影響。結果表明，攜帶pHN7A8的轉化子7A8JT和受體菌JM109的生長曲線相似，但前者對于后者有競爭優勢，未發現質粒pHN7A8對宿主菌產生適應性代價。攜帶blaCTX-M-65、rmtB和fosA3的多重耐藥質粒pHN7A8能在宿主菌中穩定傳代，臨床上應警惕大量使用或濫用抗菌藥物對其形成的選擇壓力，以防止多重耐藥質粒進一步擴散。

關鍵詞：16S rRNA甲基化酶；超廣譜β-內酰胺酶；多重耐藥質粒；適應性

近年來，16S rRNA甲基化酶基因和超廣譜β-內酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)基因關系密切，常被報道位于同一個質粒上[1]。目前，在獸醫領域也出現了兩者共同傳播的現象[2-3]。本課題組研究發現，寵物源和豬源腸桿菌中的rmtB和blaCTX-M傳播主要由IncFⅡ質粒介導[4-5]，并發現新出現的磷霉素修飾酶基因fosA3與rmtB和blaCTX-M-65相連，位于同一質粒上[6]，且rmtB與blaCTX-M-65、fosA3等耐藥基因構成的多重耐藥(multidrug resistance，MDR)質粒已在寵物源及豬源腸桿菌中傳播和擴散。本研究對已進行全序列測定的該類型質粒pHN7A8[7]進行適應性代價分析，探討其廣泛傳播的成因，為臨床控制多重耐藥質粒的傳播和擴散提供理論依據。

1材料與方法

1.1菌株及其質粒來源

多重耐藥質粒pHN7A8來源于大腸桿菌7A8，為本實驗室于2008年分離自寵物犬糞便樣品。常規質粒接合試驗和化學轉化試驗均無法獲得pHN7A8單質粒接合子或轉化子。使用質粒提取試劑盒(QIAGEN公司)提取質粒，經電泳切膠純化后采用電轉化將目的質粒pHN7A8轉化入感受態大腸桿菌JM109中，獲得轉化子7A8JT[6]。采用瓊脂稀釋法分析受體菌、供體菌及轉化子的藥物敏感性。標準菌E.coliATCC?25922及工程菌E.coliJM109為本實驗室保存。

1.2生長曲線的測定

將7A8JT和E.coliJM109劃線培養后，分別挑取單菌落到2 mL空白LB肉湯中，37 ℃ 200 r·min-1過夜培養。分別測定7A8JT和E.coliJM109的母液OD值，取OD值最接近的母液進行下一步試驗。從母液中吸取200 μL 接種到含20 mL新鮮LB肉湯的錐形瓶中，37 ℃ 200 r·min-1震蕩培養。每1 h準確吸取200 μL到96孔板中，平行吸取三次，以空白的LB肉湯作為空白對照，測定OD600 nm。

1.3競爭生長試驗

分別挑取7A8JT和E.coliJM109單菌落到4 mL LB肉湯中，37 ℃ 200 r·min-1過夜培養。取OD600 nm值最相近的初始培養物母液，以1∶1的比例均勻混合。取200 μL混合液接種到20 mL空白LB肉湯中(1∶100)，同時設6個平行，設此時為競爭試驗0 d。37 ℃ 200 r· min-1震蕩培養24 h后，取混合液200 μL接種到20 mL新鮮空白LB肉湯中(1∶100)。此操作每24 h重復一次，連續6 d。吸取已充分混勻的菌懸液200 μL，至含有1 800 μL 0.85%生理鹽水的試管中，此即為10倍稀釋，依次類推。立即向上述盛有不同稀釋倍數菌液(10-6、10-7、10-8)的平皿中倒入空白培養基或含有100 μg·mL-1阿米卡星的培養基中，使培養基與菌液混合均勻，每個稀釋度設三個平行進行菌落計數。

2結果

2.1轉化子及原菌的藥敏結果

原菌7A8對多種藥物耐藥，攜帶blaCTX-M-65、rmtB和fosA3的轉化子7A8JT對頭孢噻肟、慶大霉素、阿米卡星、氨芐西林的MIC值比受體菌的分別升高至少256倍、512倍、64倍和32倍。藥敏結果見表1。

表1轉化子及原菌對抗生素的敏感性

Table 1Susceptibitity of transformant and donor

2.2生長曲線測定

以時間(h)為橫坐標，以不同時間點的平均OD600 nm值為縱坐標，繪制7A8JT和E.coliJM109生長曲線。結果顯示，7A8JT和E.coliJM109母液的OD600 nm值分別為0.01和0.011，可認為兩者母液濃度接近一致。此外，從遲緩期到對數期和穩定期，兩者的OD600 nm值相等或相近，曲線趨于一致，表明7A8JT菌株生長能力接近于受體菌E.coliJM109。結果見圖1。

2.3競爭試驗

以采樣時間為橫坐標，轉化子7A8JT和受體菌E.coliJM109的相對含量為縱坐標作圖。結果顯示，7A8JT和E.coliJM109的母液中，兩者各占一半，六個平行的傳代培養菌液中兩者相對含量平均值為50%，表明競爭試驗開始時7A8JT和E.coliJM109起始菌量一致。到傳代培養第一天時，兩者的相對含量保持在50%，表明7A8JT和JM109的共培養未出現競爭優勢和劣勢。直至第二天后，7A8JT逐漸呈現出優勢，其相對含量在55%～66%之間變化。相比之下，不含pHN7A8的受體菌JM109的相對含量逐漸下降，表現出競爭劣勢。結果見圖2。

3討論

適應性是指耐藥菌在沒有藥物選擇壓力的情況下生長、定植等方面的能力。抗菌藥物一般作用于細菌細胞壁的生物合成、染色體超螺旋的調節、RNA轉錄和蛋白質的生物合成，因此相關部位產生的耐藥突變常常伴隨著細菌適應性的下降，但有些卻表現適應性增強。例如空腸彎曲桿菌的gyrA突變在介導其對喹諾酮類藥物耐藥的同時也使耐藥菌表現出適應性的增強[8]。耐藥質粒通常攜帶多種耐藥基因，對宿主菌的生長代謝及其在環境中的適應性造成一定影響。細菌捕獲耐藥質粒后，通常伴隨著適應性代價的產生[9]。耐藥菌的適應性研究主要包括耐藥菌是否能快速適應宿主或環境，能否在與敏感菌的生長競爭中成為優勢菌群。

細菌的生長曲線描述了細菌群體從開始生長到死亡的動態變化過程，競爭試驗反映了連續生長周期中菌株的競爭劣勢，能夠較準確地衡量適應性[10]。本研究通過測定轉化子7A8JT和受體菌E.coliJM109的生長曲線和兩者的競爭關系來分析多重耐藥質粒pHN7A8對宿主菌產生的適應性代價。7A8JT和E.coliJM109表現出相似的生長能力，但轉化子7A8JT相對于受體菌E.coliJM109具有競爭優勢，表明菌株獲得質粒pHN7A8后短期內不會有較強的適應性代價，宿主有可能適應機體或外界環境使得該質粒能夠穩定存在于宿主中。質粒pHN7A8能夠增強宿主菌適應性的原因可能是由于該質粒攜帶F33：A-：B-復制子[7]，為典型的IncFII型質粒的復制子結構，主要編碼基因是copB(repA2)、repA1和repA4。攜帶此類復制子的典型質粒如pEK499(GenBank No.EU935739)、pC15-1a(GenBank No.AY458016)、R100(GenBank No.AP000342)。雖然F型質粒為窄宿主、低拷貝的大質粒(100 kb左右)，但常常攜帶多個復制子，如FII型質粒同時攜帶FIB和FIA型復制子。F型質粒通常編碼多種毒力因子和耐藥決定因子以提高宿主菌的適應性。可見，質粒pHN7A8的復制控制系統及其攜帶的多種耐藥基因可能為減少宿主菌的適應性代價起到一定作用。其次，質粒沉溺系統可以修復質粒分配不穩定性，野生型耐藥質粒不斷累積并得以穩定傳播的一大因素是質粒沉溺系統的作用。在本研究中，pHN7A8質粒上存在三種沉溺系統，pemI-pemK、sok-mok-hok和srnB，其中hok-sok質粒沉溺系統來源于大腸埃希菌質粒R1，為毒素-抗毒素基因組合，可提高質粒穩定性。在典型復制區上下游分別銜接沉溺系統srnB和pemk-pemI，進一步保證了該質粒在宿主菌傳代中的穩定分配及遺傳。因此，質粒pHN7A8能夠在寵物源及豬源腸桿菌中傳播和擴散，可能與其能夠提高宿主菌的適應性有關。此外，質粒pHN7A8同時攜帶rmtB、blaCTX-M-65和fosA3等耐藥基因，提示多種抗生素的選擇壓力可能有助于其形成與傳播，因此臨床上應警惕大量使用或濫用抗菌藥物對其形成的選擇壓力，以防止多重耐藥質粒進一步擴散。聯合使用中藥可能有助于耐藥性的緩解[11]。

4結論

攜帶blaCTX-M-65、rmtB和fosA3多重耐藥質粒pHN7A8在宿主菌JM109中能穩定傳代。

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(編輯白永平)

Fitness Cost of a Multidrug Plasmid CarryingblaCTX-M-65，rmtB，andfosA3

HE Liang-ying#，LIU Lan-ping#，ZENG Zhen-ling，LIU Jian-hua*

(CollegeofVeterinaryMedicine，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou510642，China)

Key words:16S rRNA methylases；extended-spectrum β-lactamases；multidrug resistance encoding plasmids；fitness cost

Abstract:The objective of this study was to examine the fitness cost of a multidrug plasmid pHN7A8 carryingblaCTX-M-65，rmtB，andfosA3.Plasmid pHN7A8 carryingblaCTX-M-65，rmtB，andfosA3 fromE.coli7A8 was transferred intoE.coliJM109 by electroporation.Transformant 7A8JT containing pHN7A8 was obtained.Growth curve and growth competition experiments were performed to assess the fitness cost of pHN7A8 upon its host.Growth curve showed no significant difference between the transformant carrying pHN7A8 and sensitive recipientE.coliJM109.Competition experiments betweenE.coliJM109 strain and transformant 7A8JT revealed a competitive advantage for the transformant versus the recipient.The results showed that no fitness cost was observed for plasmid pHN7A8.More attention should be taken into account the effect of the clinical use of antibiotics on the selection of multidrug resistance encoding plasmids.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.023

收稿日期：2015-02-16

基金項目：973項目(2013CB127200)；國家自然科學基金廣東省聯合基金重點項目(U1031004)；廣東省高等學校高層次人才項目

作者簡介：何良英(1986-)，女，廣西南寧人，博士，主要從事細菌耐藥性、新型環境污染物的微生物降解研究，E-mail:heliangying@163.com；劉蘭平(1989-)，女，碩士生，主要從事細菌耐藥性研究。二人對本文貢獻相同 *通信作者：劉建華，教授，碩士生導師，Tel:(86-20)-85283824，Fax:(86-20)-85283824，E-mail：jhliu@scau.edu.cn

中圖分類號：S852.612

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)01-0172-05