phoP/Q雙組分系統對禽致病性大腸桿菌的毒力調控作用

李春曉，張宇曦，祁克宗，韓先干，涂　健，薛　挺，周秀紅

(安徽農業大學動物科技學院，合肥 230036)

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phoP/Q雙組分系統對禽致病性大腸桿菌的毒力調控作用

李春曉，張宇曦，祁克宗*，韓先干，涂健，薛挺，周秀紅

(安徽農業大學動物科技學院，合肥 230036)

摘要：phoP/Q作為一種外在環境感受器，參與調節細菌對外部環境的適應性。本研究擬探討phoP/Q雙組分系統對禽致病性大腸桿菌(APEC)的生長、定植、毒力等生物學特性的影響。利用Red重組系統構建APEC AE 17株的phoP/Q雙組分調控系統缺失株，并構建phoP/Q雙組分調控系統回復質粒，轉化缺失株，構建回復株。通過生長運動性試驗、黏附入侵CEF細胞試驗、毒力基因轉錄水平檢測以及半數致死量(LD50)等試驗比較野生株、缺失株、回復株的生物特性。與野生株相比，phoP-phoQ缺失不改變其生長特性；運動性較野生株下降63%；黏附與入侵CEF細胞能力分別降低69.83%(P<0.01)和62.17%(P<0.05)；LD50顯示毒力減弱13.3倍；polA、tsh基因轉錄水平分別上調41%、54%；sodA、iss分別下調64%和98%。phoP/Q雙組分系統參與對APEC致病性的調控，該系統的缺失會降低APEC的致病性。

關鍵詞：禽致病性大腸桿菌；phoP/Q雙組分調控系統；致病性；熒光定量PCR

禽致病性大腸桿菌(avian pathogenicEscherichiacoli，APEC) 屬于腸道外致病菌。由于其復雜的血清型和廣泛的耐藥性，一直制約著APEC疾病的防控，并給養禽業造成重大經濟損失[1-2]。影響APEC致病性的毒力因子包括黏附素、溶血素、攝鐵系統、脂多糖、侵襲素、毒素等。參與細菌毒力調控的系統主要包括有phoP/Q雙組分調控系統、QS系統、Fur系統等。APEC通過調控系統對其毒力因子進行調控，實現對宿主的感染和致病[3]。

phoP/Q是革蘭陰性菌中普遍存在的雙組分調控系統[4]。它由細菌的細胞質內的反應調節蛋白phoP(response regulator protein)和跨膜的組氨酸蛋白激酶phoQ(histidine protein kinases)組成[5]。研究表明，phoP/Q雙組分系統作為一種外在環境感受器，能被多種物質(如Mg2+、Ca2+、防御素等)激活，進而調節靶基因轉錄水平，從而引起宿主細胞對環境的改變做出適應性的調整(如增強耐酸性的能力、參與上皮細胞侵襲和抗菌肽抗感染等)[6-7]。最近的研究表明，phoP/Q系統參與對多種細菌的毒力調控[8]。在沙門菌中phoP/Q系統存在抵抗宿主抗菌肽作用，維持細菌致病力[6，9]。在鼠疫耶爾森菌中phoP/Q系統調控細菌表達一系列毒力因子，免受巨噬細胞吞噬并耐受宿主防御系統[10]。但phoP/Q基因對APEC毒力因子在發病中的調控尚未見報道[11-12]。因此本試驗利用Red重組系統構建禽致病性大腸桿菌AE17中的phoP/Q雙組分調控系統缺失株，并利用低拷貝載體pSTV28構建phoP/Q雙組分系統回復質粒，轉化缺失株內構建回復株，通過比較野生株、缺失株、回復株的生物特性，研究該系統缺失對APEC菌株的生長、定植、毒力等生物學特性的影響，為進一步研究APEC的phoP/Q雙組分調控機制提供參考。

1材料與方法

1.1載體、菌株、試劑

禽致病性大腸桿菌AE17株(O2)，本實驗室保存。限制性內切酶SalⅠ、EcoRⅠ，DNA ligation Kit Ver.2.0，pSTV 28質粒均購自大連TaKaRa有限公司。L-阿拉伯糖購自Sigma公司。大腸埃希菌DH5α、TOP10，質粒小量提取試劑盒均購自天根生化有限公司。SYBR Green PCR Master Mix和反轉錄試劑盒購于美國Promega公司。DNA-free kit購于Ambion公司。DNA marker、PCR MasterMix，購自北京康為世紀公司。96和6孔細胞板，購自美國Corning公司。TRIzol購自Invitrogen 公司。0.22 μm的無菌濾器，購自美國Millipore公司。

1.2引物設計

根據GenBank(NC_008563.1)公布的APEC O1基因序列、GenBank(KJ632656.1)公布的APEC O2phoP-phoQ基因序列和GenBank (AY048742.1)公布的pKD3質粒序列，分別設計用于擴增phoP-phoQ上、下游序列的兩對引物phoPQ-UF/phoPQ-lap-cat-UR和phoPQ-lap-cat-DF/phoPQ-DR，用于擴增氯霉素抗性片段的引物Cat-lap-phoPQ-F/Cat-lap-phoPQ-R，用于鑒定phoP-phoQ雙基因缺失株和回復株的3對引物：phoPQ-OF/phoPQ-OR、phoPQ-IF/phoPQ-IR和M13-47/M13-RV-M，以及用于構建phoP-phoQ回復的引物phoPQ-C-EcoRI-F/phoPQ-C-SalI-R。其中phoPQ-lap-cat-UR與Cat-lap-phoPQ-F、Cat-lap-phoPQ-R與Cat-lap-phoPQ-F兩對引物5′端均帶有用于進行重疊PCR(overlap-PCR)的反向互補20個堿基。引物序列見表1。

1.3缺失打靶片段的構建

分別利用引物phoPQ-UF/phoPQ-lap-Cat-UR、phoPQ-lap-Cat-DF/phoPQ-DR和Cat-lap-phoPQ-F/Cat-lap-phoPQ-R擴增回收得到phoP-phoQ上游同源臂(1 068 bp)、下游同源臂(992 bp)和氯霉素抗性片段(1 033 bp)。再使用overlap-PCR的方法利用引物phoPQ-UF/Cat-lap-phoPQ-R將phoP-phoQ上游同源臂(Up)與氯霉素片段(Cat)連接得到Up-Cat片段。最后再次使用overlap-PCR的方法利用引物phoPQ-UF/phoPQ-DR將Up-Cat片段與phoP-phoQ下游同源臂(Down)連接形成打靶片段Up-Cat-Down。打靶片段回收后，用于轉化含有pKD46質粒的AE17菌株進行缺失株的構建。

1.4缺失株的構建及抗性基因的敲除

參照文獻[13]的方法制備感受態細胞，利用同源重組方法進行phoP-phoQ基因的敲除 (圖1)。取純化好的Up-Cat-Down打靶片段約500 ng與100 μL感受態細胞混合，冰浴15 min后將混合物轉入2 mm的Bio-Rad電轉化杯中，用電轉儀進行電轉化。轉化參數設置為電壓2.3 kV、電阻200 Ω、脈沖25 μF。電擊后迅速加入900 μL SOC培養基，28 ℃振蕩培養45 min后涂于LB(Cat+)平板(氯霉素質量濃度為10 μg·mL-1)，37 ℃恒溫培養12 h，PCR鑒定具有氯霉素抗性的克隆。

表1缺失株和回復株的引物序列

Table 1Primers used in the gene deletion and complemented strains

參照上文電轉化步驟，轉化pCP20質粒至缺失株中，選擇含pCP20質粒的陽性克隆，28 ℃培養8 h后，提高到42 ℃過夜培養，通過溫度的轉換熱誘導FLP重組酶表達，接種固體LB培養基后，挑取單克隆菌落，PCR鑒定氯霉素抗性消除的缺失株AE17ΔphoPQ。

1.5回復株的構建

利用引物phoPQ-C-EcoRI-F/phoPQ-C-SalI-R擴增回收含有上游啟動子、下游終止子和phoP-phoQ基因ORF的序列C-phoPQ(2 776 bp)。使用限制性內切酶EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切處理pSTV28質粒和C-phoPQ片段，經T4連接酶連接后，轉化入DH5α，使用M13-47/M13-RV-M引物進行PCR鑒定，含有回復質粒pSTV28-C-phoPQ的陽性克隆可擴增出2 924 bp的條帶。

同樣方法制備缺失株AE17ΔphoPQ的電轉化感受態細胞。將構建好的回復質粒pSTV28-C-phoPQ電轉化入缺失株AE17ΔphoPQ中，將PCR鑒定的陽性回復株命名為AE17CΔphoPQ。

1.6生長曲線及運動性測定

參照文獻[14]的方法測定野生株、缺失株和回復株的生長曲線。參照文獻[15]的方法配制泳動(swiming)培養基(1% trytone，0.5% NaCl，0.8% glucose，0.3% agar)和進行運動性測定：取生長至OD600 nm=1.0的野生株AE17、缺失株AE17ΔphoPQ和回復株AE17CΔphoPQ各10 μL滴于平板中間，37 ℃恒溫培養12 h，觀察并測量菌落直徑的差異。

1.7細胞的黏附和入侵

將野生株、缺失株、回復株，37 ℃培養至對數期，6 000 g 4 ℃離心5 min，棄上清，菌體用無菌PBS洗滌3次，并用無抗生素的DMEM重懸。將液氮中保存的原代CEF細胞經10%胎牛血清DMEM完全培養液于25 mL細胞培養瓶中培養復蘇后，傳代于24孔細胞培養板中，置于含5% CO2細胞培養箱中37 ℃培養，當細胞長滿孔底時，以細胞專用PBS洗滌細胞3次后待用。

參照文獻[16]，設計黏附組和入侵組每組都包含上述處理的三株細菌，按感染復數(MOI)=200加入滿CEF細胞的24孔板中，對照組加入等體積的不含抗生素的DMEM，每孔做三個重復。400 g低速離心5 min，使細菌沉降至孔底與細胞充分結合，37 ℃恒溫靜置孵育1.5 h，無菌PBS洗5次。黏附組每孔加入0.1%胰酶 200 μL，室溫作用10 min，裂解細胞，稀釋后涂布LB平板，37 ℃培養后平板菌落計數進行細菌計數。入侵組每孔加入含100 μg·mL-1慶大霉素的DMEM作用1 h，無菌PBS洗3次后，用0.5% Triton X-100裂解細胞，稀釋后涂布LB平板，37 ℃培養后平板菌落計數法進行細菌計數。

1.8熒光定量PCR比較野生株和缺失株毒力基因轉錄水平差異

參照文獻[17]的方法用TRIzol法提取野生、缺失和回復株的RNA。設計禽致病性大腸桿菌毒力基因[18]——pfs、vat、luxS、tsh、fuyA、iucD、iss、yhiD、SodA、metJ、polA以及管家基因dnaE的熒光定量PCR引物[16]。引物均由上海英駿生物技術有限公司合成，見表2。熒光定量PCR反應體系為20 μL：Real time PCR Master Mix 10 μL，Primer 1(10 μmoL·L-1) 0.5 μL，Primer 2(10 μmoL·L-1) 0.5 μL，模板1 μL，ddH2O 8 μL。擴增條件：50 ℃×2 min，95℃×10 min；變性95 ℃×15 s，60 ℃×1 min，循環次數40次。數據分析采用2-ΔΔCT(Livak)法[19]，用于比較野生株和缺失株毒力基因轉錄水平差異。

表2Q-PCR所用的引物序列

Table 2Q-PCR primers used in this study

1.9半數致死量(LD50)的測定

將野生株、缺失株、回復株，37 ℃培養至對數期，PBS洗滌后重懸。對10日齡櫻桃谷鴨采用腿部肌肉注射的方式進行攻毒，分為6組，每組8只，攻毒劑量如下：1×109、1×108、1×107、1×106、1×105和1×104。攻毒后連續觀察7 d，記錄發病死亡情況并采用改良寇氏法計算半數致死量(LD50)。

2結果

2.1phoP-phoQ缺失株和回復株的鑒定

對疑似缺失株和回復株用外側引物phoPQ-OF/phoPQ-OR進行PCR鑒定，結果表明，缺失株和回復株可擴增出2 435 bp的片段(圖2A泳道1、2)，而野生株擴增的片段大小為4 432 bp(圖2A泳道3)。對疑似缺失株和回復株用內側引物phoPQ-IF/phoPQ-IR進行PCR鑒定，結果表明，缺失株未擴增出條帶(圖2B泳道5)，而回復株和野生株擴增出大小為711 bp的片段(圖2B泳道6、7)。鑒定結果表明，成功獲得AE17ΔphoPQ缺失株和AE17CΔphoPQ回復株。

2.2生長曲線及運動性檢測

對野生株、phoP-phoQ缺失株及回復株的生長曲線和運動性檢測結果(圖3、4)表明，phoP-phoQ雙基因缺失后對細菌的生長速率沒有明顯影響，但運動性顯著降低，僅為野生株的37%(P<0.01)，而AE17CΔphoPQ回復株可恢復其運動性。

2.3phoP-phoQ缺失顯著降低AE17對CEF細胞的黏附和入侵

對野生株AE17、缺失株AE17ΔphoPQ和回復株AE17CΔphoPQ對CEF細胞的黏附和入侵檢測結果表明，AE17、AE17ΔphoPQ菌株對CEF細胞的黏附能力分別為3.47×104、1.05×104CFU·孔-1；入侵能力分別為1.19×103、4.50×102CFU·孔-1。與野生株相比，缺失株對CEF的黏附和入侵能力分別降至30.17%和37.83%，敲除株黏附及入侵CEF能力較AE17均顯著的下降(P<0.05)?；貜椭昕梢曰謴蛯EF的黏附能力，回復株對CEF的入侵能力能夠部分恢復(圖5)。

2.4相關毒力基因 mRNA 水平轉錄情況

對野生株AE17、缺失株AE17ΔphoPQ和回復株AE17CΔphoPQ部分的毒力基因的mRNA轉錄分析顯示：phoP-phoQ雙基因缺失后polA和tsh基因轉錄水平分別上調41%和54%，而sodA和iss分別下調了64%和98%，其他基因的轉錄水平變化不明顯(圖6)。

2.5半數致死量(LD50)的測定

動物試驗結果顯示AE17、AE17ΔphoPQ、AE17CΔphoPQ對雛鴨的LD50分別為1.78×105、2.37×106和4.22×105CFU，表明phoP-phoQ雙基因缺失可導致APEC對櫻桃谷鴨的致病力減弱13.3倍(表3)。

表3phoP-phoQ基因缺失對APEC致病性(LD50)的影響

Table 3The effects of phoP-phoQ deletion mutant on LD50of APEC

3討論

革蘭陰性菌中phoP/Q雙組分系統即為一種外在環境感受器，參與調節細菌對外部環境的適應性[20]。有研究推測革蘭陰性菌的phoP-phoQ作用機制可能是調節細菌外膜蛋白以及LPS結構，使其能與宿主抗菌肽結合，減小了宿主抗菌肽從細菌表面競爭二價金屬離子的量或作用強度，進而減弱宿主清除細菌的能力，維持細菌致病力[9-10，21]。

本研究結果表明，缺失株AE17ΔphoPQ在生長曲線上較野生株并沒有明顯變化，而運動性較野生株下降了63%，這與C.J.Alteri等報道的phoP缺失株運動性增強相反[22]。推測phoP和phoQ可能對細菌的群集運動都有顯著的調控影響，phoP單缺失會造成細菌運動能力增強，而phoP/Q雙組分全部缺失會造成細菌運動能力降低[23]，但其具體機制仍有待進一步研究。

細菌黏附于宿主細胞或其他機體表面對細菌的定殖、感染至關重要[24-25]。APEC在自然條件下一般先在禽類的呼吸道表面定殖，繼而感染肺部，然后才進入血液并進行擴散，導致機體發病。為了驗證phoP/Q雙組分系統對APEC定植感染能力的影響，本試驗對phoP-phoQ缺失前后APEC黏附和入侵CEF細胞能力以及對禽類的LD50進行檢測。結果顯示缺失株的黏附及入侵能力均較野生株下降明顯(P<0.05)，LD50也較野生株下降了13.3倍，而回復株毒力與基因的表達有關，而基因的表達與之相連載體的表達有關，所以回復株毒力與原始株相比有所降低，但恢復大部分感染及致病能力。結果表明phoP/Q雙組分系統對APEC致病性具有重要調控作用。這與其他細菌中相關研究類似，phoP/Q雙組分系統的缺失能降低細菌對宿主的致病性，在福氏志賀菌中phoP/Q雙組分的突變降低了其對PMNs (多形核白細胞)和抗菌肽的抵抗能力，進而降低其致病性[26]。

phoP/Q雙組分系統中，組氨酸蛋白激酶phoQ通過感受外界信息變化激活phoP蛋白；反應調控蛋白phoP通過調節細胞內H+的外排，產生質子動力來調控下游基因的表達[22]。本研究對pfs、vat、luxS、tsh、fuyA、iucD、iss、yhiD、SodA、metJ和polA等基因的轉錄水平進行檢測，在phoP-phoQ缺失后APEC的polA(DNA修復相關)、tsh(黏附相關)基因轉錄水平均顯著上調(P<0.05)；sodA(超氧化酶)、iss(血清存活)的轉錄水平均極顯著下調(P<0.01)。結果表明phoP/Q雙組分系統可能參與多種APEC毒力基因的調控，影響APEC對宿主的致病性。

iss與tsh是APEC的關鍵致病基因，對其毒力影響顯著[27-28]。phoP-phoQ雙基因缺失前后對比，iss轉錄水平下調了98%，這可能造成在腿部肌肉攻毒后細菌在體內的血清存活能力下降明顯；盡管tsh轉錄上調了0.54倍，但缺失株毒力仍然下降13.3倍。這與在沙門菌上，phoP/Q任意一基因的敲除會造成其不同毒力因子轉錄升高或者下降，但細菌毒力下降一致[29]。黏附因子tsh在缺失株中轉錄水平上調，而缺失株黏附DEF細胞能力卻降低，可能是由于細菌中存在多種不同的黏附素[24，30]，tsh只是其中之一。此外，細菌對細胞的入侵黏附是個多因子共同作用的過程。本研究中，polA和sodA轉錄的改變，其原因可能與在沙門菌中一樣，是由于phoP/Q的缺失，導致細菌喪失對跨膜電化學梯度的調控，進而引起電化學梯度敏感性基因轉錄水平的改變[22]。

4結論

phoP/Q雙組分系統對APEC的致病性具有重要調控作用，phoP-phoQ雙基因的缺失會造成APEC致病性明顯減弱。本研究為進一步開展phoP/Q雙組分系統對APEC的致病作用的探討提供參考。

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(編輯白永平)

The Role of phoP/Q Two-component System in Virulence of Avian PathogenicEscherichiacoli

LI Chun-xiao，ZHANG Yu-xi，QI Ke-zong*，HAN Xian-gan，TU Jian，XUE Ting，ZHOU Xiu-hong

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，AnhuiAgriculturalUniversity，Hefei230036，China)

Key words:avian pathogenicEscherichiacoli；phoP/Q two-component system；pathogenicity;real-time PCR

Abstract:As a kind of external environment receptor，phoP/phoQ is involved in regulating bacterial adaptability to external environment.The aim of this study was to investigate the effect of phoP/Q two-component system to biological characteristics of avian pathogenicEscherichiacoli(APEC) such as growth，engraftment，and virulence.The phoP-phoQ deletion mutant strain was constructed by homologous recombination assay，and the complement strain was constructed through transformation deletion strain with the plasmid complement.The growth curve determination and motility assay，the adhesion and invasion to chicken embryo fibroblast (CEF)，detection of virulence gene transcription and median lethal dose (LD50) experimental were used to compare biological characteristics of wild strain，deletion strain and complement strain.Compared with the wild strain，the growth characteristics of the mutant strain did not change；the motility of the mutant strain felled by 63% comparing with wild strain；its ability of adhesion and invasion to DEF cells respectively decreased to 69.83% and 62.17%；and LD50was significantly reduced by 13.3 times.The transcription ofpolA，tshrespectively increased by 41% and 54%，while thesodAandissdecreased by 64% and 98%.The phoP/Q two-component system is involved in the regulation of the APEC pathogenic，and its deletion can reduce the pathogenicity of APEC.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.021

收稿日期：2015-06-29

基金項目：國家自然科學基金項目(31372402)；安徽省自然科學基金(1508085SQC206)

作者簡介：李春曉(1990-)，女，河南駐馬店人，碩士生，主要從事獸醫疫病病理研究，E-mail：18756903021@163.com *通信作者：祁克宗(1962-)，男，安徽合肥人，教授，碩士生導師，主要從事獸醫疫病病理研究，E-mail：qkz@ahau.edu.cn

中圖分類號：S852.612

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)01-0157-08