豬源產新德里金屬β-內酰胺酶-1大腸埃希菌的感染特性研究

常世愷，趙戰勤*，薛　云，龍　塔，丁　軻，程相朝

(1.河南科技大學動物科技學院，河南省高等學校環境與畜產品安全重點學科開放實驗室，洛陽 471003；2.河南科技大學醫學技術與工程學院，微生物檢驗實驗室，洛陽 471003)

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豬源產新德里金屬β-內酰胺酶-1大腸埃希菌的感染特性研究

常世愷1，趙戰勤1*，薛云2，龍塔1，丁軻1，程相朝1

(1.河南科技大學動物科技學院，河南省高等學校環境與畜產品安全重點學科開放實驗室，洛陽 471003；2.河南科技大學醫學技術與工程學院，微生物檢驗實驗室，洛陽 471003)

摘要：對豬源產NDM-1大腸埃希菌E120413株在豬群中的交互傳播、致病力和體內分布特性等進行初步探討。仔豬糞便樣本的細菌學檢測結果表明，E120413株細菌能從接種仔豬快速傳染給未接種的同居組仔豬；接種組仔豬糞便樣本檢測到E120413株細菌的持續時間最短為7周，最長超過11周；同居組的持續時間介于7～9周。仔豬血液樣本的檢測結果表明，E120413株細菌能快速突破仔豬的免疫防御進入血液循環形成菌血癥；接種組和同居組仔豬菌血癥的持續時間為第2—10天和第4—10天，并在第7天達到最高活菌濃度3.7×105和4.3×105CFU·mL-1。仔豬組織樣本的檢測結果表明，從感染仔豬的腦、心、肝、脾、肺、腎、胃、腸系膜淋巴結和十二指腸中均能分離到該菌，且能在十二指腸長期存在(≥11周)。但仔豬的臨床癥狀與病理學檢查結果表明，該菌僅能引起感染豬的體溫升高和輕微的局部炎癥反應，并不能導致豬的明顯臨床癥狀和嚴重病理變化。產NDM-1大腸埃希菌E120413株對豬具有較強的傳播擴散能力和持續感染能力。

關鍵詞：豬；大腸埃希菌；NDM-1；感染

“超級細菌”是具有廣泛耐藥性(pan-drug resistance，PDR)細菌的總稱，包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、多重抗藥性肺炎鏈球菌、耐萬古霉素腸球菌、多重抗藥性結核桿菌等。各種“超級細菌”的不斷出現給人類健康帶來極大威脅[1-2]。攜帶有新德里金屬β-內酰胺酶-1(New Delhi metallo-β-lactamase-1，NDM-1)耐藥基因(blaNDM-1)的細菌是一種新型的“超級細菌”。該類細菌能產生一種特殊的β-內酰胺酶，其活性部位為金屬離子，最初源于在印度首都新德里有旅行史的患者，所以得名NDM-1[3]。NDM-1能抵抗幾乎所有的抗生素，給臨床治療帶來極大威脅[4-5]。目前，世界上40多個國家和地區的人群已被發現攜帶blaNDM-1基因的“超級細菌”[6-8]。令人擔憂的是，近幾年英國學者又從印度新德里的生活環境中(包括飲用水、池塘、城市排水系統等)分離到攜帶blaNDM-1基因的多種革蘭陰性桿菌，其中11種細菌是首次發現，包括對人類致病力較強的鮑氏志賀菌和霍亂弧菌[9-10]。迄今為止，發現攜帶blaNDM-1基因的細菌多為腸桿菌科細菌，這些細菌多為消化道的正常菌群或條件性致病菌，少數為致病菌[9，11]。目前，國內外均沒有在動物體內檢出產NDM-1細菌的報道。2012年4月，作者實驗室從臨床送檢豬的病料樣品中分離出1株產NDM-1大腸埃希菌，并對blaNDM-1基因進行了初步的序列分析。豬作為多種微生物進化的“混合器”，豬源產NDM-1“超級細菌”的傳播特性以及公共衛生學意義值得進一步研究。本研究探討了該菌在豬群中的交互傳播、致病力和體內分布特性，為客觀評估豬源產NDM-1細菌在豬群內部的擴散能力提供了重要參考依據。

1材料與方法

1.1菌株、材料與實驗動物

豬源產NDM-1大腸埃希菌E120413株由河南科技大學河南省高等學校環境與畜產品安全重點學科開放實驗室分離鑒定并保存。

LB培養基購自美國BD公司。碳青霉烯類抗生素厄他培南(ertapenem)購自美國MERCK公司；TaqDNA聚合酶、基因組提取試劑盒購自上海SANGON公司；PCR引物由上海SANGON公司合成。

8～9周齡長白仔豬購自洛陽盛平華多種豬有限公司。

1.2仔豬接種試驗

將豬源產NDM-1大腸埃希菌E120413株接種于含厄他培南(終質量濃度為1 μg·mL-1)的LB平皿上，37 ℃培養16～18 h，挑取單菌落純化培養1次，用5～7 mL無菌PBS(0.01 mol·L-1、pH7.2)洗脫菌苔，混合均勻后對細菌懸液進行活菌計數。將22頭8～9周齡健康仔豬隨機分為3組(9頭、9頭和4頭)。第1組為接種組，每頭仔豬通過口腔灌服上述菌液2 mL(含活菌1.1×1010CFU)。第2組為同居組，每頭仔豬均通過口腔灌服無菌LB培養基2 mL；第2組和第1組仔豬同圈混合飼養。第3組為空白對照組，每頭仔豬均通過口腔灌服無菌LB培養基2 mL，進行隔離飼養。每日觀察、記錄所有仔豬的臨床癥狀，測定接種前及接種后1～10 d的直腸溫度變化。

1.3仔豬糞便樣本的細菌檢測

于接種前和接種后不同時間點(表1)，無菌采取所有仔豬的直腸糞便樣本5 g到離心管中，用無菌PBS 5 mL溶解糞便樣本，劇烈振蕩3 min，4 000 r·min-1離心1 min，轉移上清液到另一個無菌離心管中，參考文獻所述方法[12-13]使用含厄他培南(1 μg·mL-1)的LB平皿進行活菌計數。同時，對計數平板上的生長菌落進行blaNDM-1基因的PCR檢測[14]。

表1仔豬糞便樣本中E120413株大腸埃希菌的含量變化規律

Table 1Persistence ofEscherichiacoliE120413 strain in fecal samples of piglets

a.仔豬接種E120413株劑量為1.1×1010CFU·頭-1；b.接種前的樣品數據；c.仔豬被剖檢；V.平均值；N.不統計或無檢測數據

a.Piglets were inoculated with 1.1×1010CFU E120413 strain；b.Values of pre-inocubation；c.Piglets were dissected；V.The mean values；N.Not tested or no data

1.4仔豬血液樣本的細菌檢測

于接種前和接種后不同時間點(表2)，通過前腔靜脈采取仔豬血液到EDTA抗凝采血管中。按文獻所述方法[12-13]使用含1 μg·mL-1厄他培南的LB平皿進行活菌計數。同時，對計數平板上的生長菌落進行blaNDM-1基因的PCR檢測[14]。

表2仔豬血液中E120413株細菌的含量變化規律

Table 2Persistence of E120413 strain in blood samples of piglets

a.仔豬接種E120413株劑量為1.1×1010CFU·頭-1； N.仔豬被剖檢，無檢測數據

a.Piglets were inoculated with 1.1×1010CFU E120413 strain；N.Piglets were dissected and not tested

1.5仔豬的病理學檢查及其組織樣本的細菌檢測

參考文獻按[15]所述方法進行，簡述如下。于試驗開始后1、2和11周，分別從接種組、同居組中各取2、2和4頭仔豬(表1)進行病理學剖檢。每頭豬無菌采取心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、十二指腸和腸系膜淋巴結組織各5 g，剪碎，分別與5 mL無菌PBS混合，勻漿器勻漿，然后轉入10 mL離心管中靜置5 min，取上清按文獻所述方法[12-13]使用含厄他培南(1 μg·mL-1)的LB平皿進行活菌計數。同時，使用10%的甲醛溶液對各組織進行固定，制作病理切片，并觀察其病理組織學變化。每批次剖檢時取1頭PBS對照組仔豬作為健康對照。

2結果

2.1仔豬腸道中的細菌動態變化規律

仔豬腸道細菌的檢測結果表明(表1)，在接種豬源產NDM-1大腸埃希菌E120413株后2 d(48 h)，所有接種組仔豬的糞便樣品均能檢測到該菌，其活菌含量介于2.3×103～3.6×104CFU·g-1之間，平均含量為1.2×104CFU·g-1。然后開始下降，而在第4天和第14天下降最為顯著(χ2-test：P<0.001)，但在接種后7周內，所有仔豬均能檢測到該菌。在接種后8周，5頭仔豬(期間9頭仔豬中有4頭用于剖檢，結果見表1)中2號和4號已不能檢測到，但3號仔豬一直持續到11周仍能檢測到。在試驗開始后2 d(48 h)，同居組12號仔豬的糞便樣品已能檢測到E120413株細菌。在第4天，所有同居組仔豬的糞便樣品均能檢測到該菌。然后其平均含量快速上升(χ2-test：P<0.001)，在第10 天達到最大值2.4×103CFU·g-1。與接種組相似，在第14天開始劇烈下降(χ2-test：P<0.001)，但在試驗開始后4 d至7周內，所有仔豬均能檢測到E120413株細菌。其中，12號仔豬攜帶E120413株細菌的持續時間最長，為9周；11號的持續時間最短，為7周。

這些試驗結果表明，E120413株細菌能從接種仔豬快速傳染給未接種的同居組仔豬，且在腸道中長期存在(≥7周)。

2.2仔豬血液中的細菌動態變化規律

仔豬血液中的細菌檢測結果(表2)表明，接種組仔豬血液樣品中能檢出E120413株大腸埃希菌的時間介于第2—10天。接種后2 d，在2和6號仔豬血液中即能檢出E120413株細菌，第4天，所有仔豬血液中均能檢出該菌，其活菌含量介于5.4×103～2.2×104CFU·mL-1之間，平均含量為1.2×104CFU·mL-1。第7天，其平均含量進一步升高到3.7×105CFU·mL-1。第10天，1、2、4、7號仔豬血液中已不能檢出E120413株細菌。在試驗開始后2 d，同居組仔豬血液中均不能檢出E120413株細菌。但第4天，所有同居組仔豬的血液樣品中均能檢出E120413株細菌。第7天，其平均含量進一步升高到4.3×105CFU·mL-1。第10天，5頭仔豬中，13和16號已不能檢出。同居組仔豬血液樣品中能檢出E120413株細菌的時間介于第4-10天。2和3周后，所有接種組和同居組仔豬血液樣品中均沒有檢出E120413株細菌。5、7、9、11周后，所有仔豬血液樣品中也均不能檢出E120413株細菌(數據略)。

這些試驗結果表明，E120413株細菌能快速突破仔豬的免疫防御進入血液循環形成菌血癥。

2.3仔豬器官組織中的細菌分布

仔豬不同組織中的細菌檢測結果(表3)表明，接種后1周，從接種組和同居組仔豬的心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、腸系膜淋巴結和十二指腸中均能分離到E120413株大腸埃希菌，這與仔豬所呈現的菌血癥結果(表2)一致，也表明該細菌能導致仔豬發生全身性的系統感染。接種后2周，從接種組(6號和7號)和同居組(15號和16號)仔豬的腎和胃組織中均未能檢出E120413株細菌，但在其他組織中仍能檢出該菌。接種后11周，接種組4頭中的2、4號和同居組4頭中的11、14號仔豬的各組織臟器中均未能檢出E120413株大腸埃希菌。但是，從接種組3號仔豬的肝和十二指腸，5號仔豬的十二指腸以及同居組12、13號仔豬的十二指腸中仍檢出了E120413株細菌，表明該菌能在感染豬的某些組織，特別是十二指腸中長期(≥11周)定植。

這些試驗結果表明，E120413株細菌能導致仔豬發生全身性的系統感染，且能在某些組織中持續存在。

2.4仔豬的臨床癥狀與病理學檢查

臨床癥狀觀察結果表明，接種組和同居組仔豬的精神狀態和食欲情況均正常，均沒有發生腹瀉、嘔吐、呼吸困難和死亡等臨床癥狀，與隔離飼養的PBS空白對照組仔豬相比沒有明顯差異。接種組和同居組仔豬在接種后4～8 d出現了體溫升高，但平均升高不超過1 ℃，且在9 d后恢復正常。

在接種后1、2和11周，分別對部分仔豬進行病理學剖檢，發現接種組和同居組仔豬的心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、淋巴結、膀胱等組織均無明顯病理變化，與PBS對照組相比沒有肉眼可見的差異。病理組織學觀察結果表明，各組織結構完整、細胞排列規則，無細胞壞死、出血等病理變化。僅在1周后剖檢的接種組和同居組仔豬的肺、十二指腸和腦組織中發現了輕微的充血、炎性細胞浸潤等病理變化。

這些試驗結果表明，該菌僅能引起感染豬的體溫升高和輕微的局部炎癥反應，并不能導致豬的明顯臨床癥狀和嚴重病理變化。

表3仔豬器官組織中E120413株細菌的檢測結果

Table 3Persistence of E120413 strain in deep organs of piglets

a.仔豬口服接種E120413株劑量為1.1×1010CFU·頭-1；b.腸系膜淋巴結

a.Piglets were orally inoculated with 1.1×1010CFU E120413 strain；b.Mesenteric lymph nodes

3討論

產NDM-1細菌是一類新型細菌，幾乎對所有抗生素都有耐藥性，給人類健康帶來極大威脅[4-5]。自2009年首次被發現以來，從人類病原菌群、正常菌群甚至環境微生物中均發現了該類細菌[9-10]。但是，目前均沒有在動物體內檢出產NDM-1細菌的報道。本實驗室于2012年4月首次分離到1株豬源產NDM-1大腸埃希菌，然后又在不同豬群中陸續分離到4株，這表明產NDM-1細菌在豬群中不是偶然出現和存在的，而具有一定的廣譜性。抗生素濫用是“超級細菌”不斷出現的首要原因。隨著抗生素濫用情況的不斷加劇，回顧產NDM-1“超級細菌”在世界范圍內迅速傳播的歷史，不難理解blaNDM-1基因從人源細菌到環境微生物的擴散之路。因此，在豬身上發現產NDM-1“超級細菌”并非偶然。但是，鑒于豬與人類的健康關系密切，豬源產NDM-1“超級細菌”的出現必然引起人們對這一特殊耐藥細菌的來源以及傳播特性的疑慮和擔心，也凸現出豬源產NDM-1“超級細菌”在公共衛生學上的重要地位。

與其他多重耐藥菌感染相似，產NDM-1細菌主要感染類型包括泌尿道感染、傷口感染、醫院獲得性肺炎、呼吸機相關性肺炎、血流感染、導管相關感染等[6，8，10]。本研究中，在試驗開始2 d后，同居組仔豬的糞便樣品已能分離出豬源E120413株細菌，且其平均含量在第4—10天快速上升到2.4×103CFU·g-1。這些試驗結果說明該菌能從帶菌動物快速傳播給同群動物并在仔豬腸道內大量增殖；而其傳播途徑是經呼吸道還是消化道感染，或是兩者兼而有之尚需進一步研究。接種組和同居組仔豬糞便中的帶菌時間均在7周以上，最長可超過11周，這表明E120413株細菌在仔豬腸道內的定植能力較強，仔豬消化道對該菌的清除能力較弱。而該菌在仔豬腸道的持續存在能力，并不斷向環境中排菌，給其傳播擴散創造了條件。

接種2 d后，在2號和6號仔豬血液中即能檢出E120413株細菌；4 d后，包括同居組在內的所有仔豬血液中均分離到該菌。這表明口服接種的E120413株細菌不僅能在豬腸道內大量增殖和持續存在，而且能突破其局部免疫防御進入血液循環系統，并形成菌血癥。無論是接種組還是同居組仔豬，7 d后即從所有主要臟器中分離到該菌，暗示該菌是通過血液循環快速到達全身各個器官組織，從而形成全身性的系統感染。但是，從感染豬的臨床癥狀與剖檢病變可以看出，該菌僅能引起感染豬的體溫升高和輕微的局部炎癥反應，并不能引起豬的明顯臨床癥狀和嚴重病理變化。令人驚奇的是，在沒有明顯臨床癥狀和病理變化的情況下，在所有豬的腦組織(7和14 d)中也檢測到了E120413株細菌，且含量相對較高，其順利突破豬血腦屏障的侵襲機制值得進一步研究。E120413株細菌在仔豬十二指腸存在的時間較長且含量較大，這可能是因為大腸埃希菌對該器官具有更強的組織嗜性[16-17]，也暗示E120413株細菌可能在十二指腸形成一個儲存庫，然后通過淋巴流或血流擴散到全身各處，最終形成局部或系統的感染與免疫反應[16，18]。

4結論

豬源產NDM-1大腸埃希菌E120413株在豬群中具有較強的交互傳播能力和持續感染能力，但其致病力較弱。這為豬群中產NDM-1細菌的防治，也為客觀評估該菌在豬群內部的擴散能力及其對人的潛在風險提供了參考依據。

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(編輯白永平)

Transmissibility of New Delhi Metallo-β-lactamase-1-ProducingEscherichiacoliIsolate from Pig

CHANG Shi-kai1，ZHAO Zhan-qin1*，XUE Yun2，LONG Ta1，DING Ke1，CHENG Xiang-chao1

(1.LabofVeterinaryMicrobiology，CollegeofAnimalScienceandTechnology，HenanUniversityofScienceandTechnology，Luoyang471003，China；2.LabofMedicalEngineering，CollegeofMedicalTechnologyandEngineering，HenanUniversityofScienceandTechnology，Luoyang471003，China)

Key words:pig；Escherichiacoli；NDM-1；infection

Abstract:One NDM-1-ProducingEscherichiacolistrain，designated as E120413，was isolated from a clinical pig case in China.Here we determined its transmissibility，pathogenicity andinvivodistribution in pigs.We performed kinetic bacterial distribution assays of porcine fecal samples，blood samples and organ tissues.The results demonstrated that E120413 strain can quickly infect the Close contacts of piglets from the inoculated piglets after being given 2 mL of the bacterial suspension containing 1.1×1010CFU of E120413 strain.In these two groups，similar numbers of organisms were isolated from the fecal samples of these two groups of piglets，giving the longest persistence terms of over 11 weeks and 9 weeks，respectively.The E120413 organisms also could be isolated from the blood samples from day 2 to day 10 in the inoculated piglets and from day 4 to day 10 in the control piglets with the peaks of 3.7×105and 4.3×105CFU·mL-1respectively，suggesting that the E120413 organisms might reach the porcine blood circulation and tissues effectively after infection.The presence of live E120413 organisms was then observed in brain，heart，liver，spleen，lung，kidney，stomach，duodenum，and mesenteric lymph nodes in both oral delivery group and control group.The stronger persistence of E120413 organisms in the mesenteric lymph nodes (≥11 weeks) may result from the environment，which was less hostile than that in any other organs of pig based on tissue specificity.But，no obvious signs of disease and serious pathological changes were observed in these two groups of pigs during the entire experimental period.In conclusion，we have shown that the NDM-1-ProducingEscherichiacoliE120413 strain has the stronger transmissibility and ability to cause persistent infection in pigs.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.020

收稿日期：2015-06-03

基金項目：國家自然科學基金項目(31302106)；河南省科技攻關計劃項目(132300410279)

作者簡介：常世愷(1989-)，男，河南安陽人，碩士生，主要從事動物病原微生物學研究，E-mail：cskvip8@qq.com *通信作者：趙戰勤(1980-)，男，博士，副教授，E-mail：zhaozhanqin@126.com

中圖分類號：S852.612

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)01-0149-08