馬立克病病毒與禽網狀內皮增生病病毒的混合感染及在傳代過程中的重組

宿靖偉，滕　蔓，羅　俊，*，遲佳琦，余祖華，禹樂樂，胡　博，張改平*

(1.河南省農業科學院動物免疫學重點實驗室，農業部動物免疫學重點實驗室，河南省動物免疫學重點實驗室，鄭州 450002；2.河南農業大學牧醫工程學院，鄭州 450002；3.河南科技大學動物科技學院，動物疫病與公共安全重點實驗室，洛陽 471003)

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馬立克病病毒與禽網狀內皮增生病病毒的混合感染及在傳代過程中的重組

宿靖偉1，2，滕蔓1，羅俊1，3*，遲佳琦1，余祖華3，禹樂樂1，胡博1，張改平1，2*

(1.河南省農業科學院動物免疫學重點實驗室，農業部動物免疫學重點實驗室，河南省動物免疫學重點實驗室，鄭州 450002；2.河南農業大學牧醫工程學院，鄭州 450002；3.河南科技大學動物科技學院，動物疫病與公共安全重點實驗室，洛陽 471003)

摘要：旨在了解國內雞群馬立克病病毒(MDV)和禽網狀內皮增生病病毒(REV)的混合感染及自然重組狀況，探討兩種病原的基因重組對MDV病原學特性的潛在影響及危害。利用PCR擴增、序列測定及間接免疫熒光試驗(IFA)，對來自河南商品蛋雞群的17個MDV分離株進行研究。結果表明，其中兩個毒株HNGS206和HNXZ103的病毒基因組中存在REV—LTR的重組插入。進一步的IFA結果顯示，HNGS206和HNXZ103并非MDV與REV的自然重組流行毒株，這兩個毒株基因組中LTR的插入發生于臨床病例雞混合感染后的病毒分離及傳代培養過程中。結果提示，雖然目前國內雞群中MDV和REV的混合感染較為普遍，但MDV與REV自然重組毒株的流行狀況仍需要進一步的流行病學監測。

關鍵詞：馬立克病病毒；禽網狀內皮增生病病毒；流行病學；混合感染；病毒傳代；基因重組

此前研究發現，REV基因組RNA轉錄產生的DNA中間產物(即前病毒)可以整合到宿主細胞的DNA中。由于REV前病毒的整合靶標為雙鏈DNA，除宿主細胞DNA外，它還可以整合到細胞內共存的其他禽皰疹病毒基因組中，如MDV[8-10]。1992年，這種現象首次報道于MDV和REV共感染細胞的傳代培養過程中[8]，之后美國[11]、波蘭[12]及我國學者[13]都先后報道了關于MDV和REV重組相關的研究。值得一提的是，REV的部分基因組片段如長末端重復序列(long terminal repeat，LTR)重組進入MDV基因組可改變其重組位點附近基因的表達[14-15]。無論是經過共培養或是細菌人工染色體(bacterial artificial chromosome，BAC)技術構建的含REV-LTR插入的MDV毒株，在細胞中的增殖明顯增強，并且對宿主的致病力也發生了一定改變[15-16]。進一步的研究發現，REV-LTR的插入可增強MDV的水平傳播能力[17-18]。上述研究表明，MDV基因組中整合REV前病毒基因序列可能影響其病原生物學特性及致病性。因此，系統研究雞群中自然發生的MDV重組毒株的流行病學，對MD的有效防控具有重要意義。

在實際生產中，盡管小雞出孵當天即進行MDV疫苗免疫接種，MD病例在我國仍時有暴發或零星散發。2005年，MDV與REV重組毒株在我國的流行及病毒分離首次報道于廣西省雞群[13]，但這種重組病毒對國內養禽業的潛在影響目前尚不清楚。近年來，河南全省范圍內多個地區小規模蛋雞場暴發了MD[19-20]，作者從這些發病雞群中成功分離到17個MDV流行毒株[21]，并且基于Meq、gB和gE基因系統發生樹分析發現與美國、澳大利亞、日本以及印度的MDV分離株相比，河南分離株與國內其他分離株一起單獨形成一個較大的進化分支，并且強毒株具有一定的區域流行特征[20-21]。為了解國內雞群流行毒株中MDV和REV的自然重組狀況，本研究對這些分離株中REV的共感染及重組情況進行了進一步追蹤研究。

1材料與方法

1.1毒株

MDV河南分離株17個，包括HNGS101(p5)、HNGS201(p4)、HNGS206(p2、p3、p4、p6)、HNXZ101(p5)、HNXZ103(p3、p4、p9、p11)、HNXZ106(p5)、HNLC107(p4)、HNLC202(p4)、HNLC203(p4)、HNLC401(p5)、HNLC502(p4)、HNLC503(p4)、HNLH302(p5)、HNLH303(p7)、HNLH304(p5)、HNLH305(p4)和HNSC105(p11)，均由本實驗室分離保存[21]。MDV超強毒株GX0101(病毒基因組中整合有REV-LTR序列)[13，17，22]和REV分離株HA9901[23]，均由山東農業大學動物醫學院崔治中教授饋贈。

1.2試劑

Premix ExTaqTM、Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、pMD19-T載體連接試劑盒和JM109感受態細胞，均購自TaKaRa公司。TRIzol購自Invitrogen公司。DMEM培養基購自Gibco公司。胎牛血清購自Hyclone公司。 REV gE蛋白單抗(11B118)和MDV gB蛋白單抗(BA4)，均由山東農業大學動物醫學院崔治中教授饋贈。熒光標記的羊抗鼠IgG購自Abbkine公司。

城鄉學生運動素質指標比較（表3）調查顯示，除握力外，城市和農村男生50m跑、立定跳遠、耐力跑、肌力、坐位體前屈差異均有統計學意義（P＜0.01），除肌力外，城市和農村女生的50m跑、立定跳遠、耐力跑、肌力、坐位體前屈差異均有統計學意義（P＜0.01）。

1.3病毒培養及DNA提取

取7～9日齡SPF雞胚，制備雞胚成纖維細胞(chicken embryo fibroblast，CEF)用于MDV GX0101超強毒株、HNGS101等河南分離株及REV分離株HA9901的病毒接種及擴大培養[21]，觀察細胞病變并收集病毒感染細胞，各MDV毒株及陰性對照細胞DNA的提取按此前文獻報道方法進行[21]，-30 ℃凍存備用。

1.4RNA提取

取1.3所述MDV、REV各毒株感染的CEF細胞及CEF陰性細胞，用TRIzol法常規提取總RNA，用NanoDrop ND1000分光光度計測定RNA濃度，并用甲醛變性膠電泳進行分析，檢測提取的RNA完整性，-30 ℃保存備用。

1.5引物設計

根據GenBank中已報道的MDV參考毒株Md5病毒基因組序列，用Primer Premier 5.0軟件設計MDVgE基因特異性引物1對(表1)。同時，根據已報道的REV代表性毒株基因序列，分別設計針對REV-LTR、pol及gag基因的特異性引物各1對(表1)。上述引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1MDV和REV基因擴增引物

Table 1 Primers specific for the viral genes of MDV or REV

1.6PCR及基因克隆測序

取“1.3”所提取的DNA作為模板，以GX0101感染細胞DNA和CEF陰性細胞DNA分別作為陽性及陰性對照，用 MDVgE基因及REV-LTR基因的特異性引物(表1)進行PCR擴增。20 μL的PCR體系包括：ExTaqDNA聚合酶10 μL，20 μmol·L-1的上下游引物各0.5 μL，200 ng·μL-1的DNA模板各1 μL，ddH2O 8 μL。MDVgE基因的PCR反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s、58 ℃復性30 s、72 ℃延伸2 min，共30個循環；最后72 ℃延伸10 min。 REV-LTR基因的PCR反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s、58 ℃復性30 s、72 ℃延伸30 s，共30個循環；最后72 ℃延伸10 min。對各PCR產物進行基因克隆[20-21]，最后送樣至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.7RT-PCR

取“1.4”所述RNA樣品各2 μg，以REV HA9901感染細胞RNA和CEF陰性細胞RNA樣品分別作為陽性及陰性對照，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒按照試劑盒操作說明書去除基因組DNA，然后用REVpol、gag基因下游引物(表1)進行反轉錄，各取cDNA 1 μL用于PCR擴增。20 μL的PCR體系包括：ExTaqDNA聚合酶10 μL，20 μmol·L-1的上下游引物各0.5 μL，cDNA模板各1 μL，ddH2O 8 μL。REVgag基因的PCR反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s、55 ℃復性45 s、72 ℃延伸45 s，共30個循環；最后72 ℃延伸10 min。REVpol基因的PCR反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s、60 ℃復性45 s、72 ℃延伸45 s，共30個循環；最后72 ℃延伸10 min。各取4 μL PCR產物，用2%瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

1.8間接免疫熒光試驗

常規方法制備CEF，至細胞形成單層后即可接種病毒[21]。用含1%胎牛血清的DMEM重懸MDV河南分離株、GX0101及REV分離株HA9901的病毒液，MDV按每孔10 PFU·100 μL-1、REV按每孔103TCID50·100 μL-1的劑量各接種3孔，同時設3孔未接毒細胞作為陰性對照，于5% CO2培養箱中培養4～5 d，當出現明顯病毒蝕斑或細胞病變時，用REV單抗11B118和MDV單抗BA4分別進行間接免疫熒光試驗(indirect immunofluorescent assay，IFA)[18]，檢測兩種病毒共感染情況。

2結果

2.1MDV分離株gE基因及REV-LTR的PCR

對GX0101和HNGS101等河南分離株最高代次病毒感染的CEF細胞DNA進行gE基因的PCR擴增，電泳分析結果顯示，17個分離株樣品及GX0101陽性對照中均擴增出與預期大小相符的特異性PCR產物，而CEF陰性對照樣品未擴增出任何產物(圖1A)，表明成功進行病毒分離株的復蘇及傳代培養。而對REV-LTR基因的PCR擴增結果顯示，MDV河南分離株中，僅有HNGS206(p6)和HNXZ103(p11)的DNA中擴增出了與預期大小相符的PCR產物，與陽性對照GX0101的擴增結果一致(圖1B)，表明這兩個MDV分離株基因組中可能存在REV-LTR的重組。

2.2MDV分離株REV-LTR的PCR產物測序

將從HNGS206和HNXZ103分離株DNA樣品中擴增的REV-LTR PCR產物割膠回收并克隆測序，分析結果顯示，兩個PCR產物的序列長度均為367 nt，與預期產物長度完全一致。用MegAlign軟件進行比對分析顯示，二者僅第48和第289位核苷酸不同。Blast分析結果顯示，與GenBank中已發表的REV多個毒株的LTR序列相比，兩個擴增片段的核苷酸序列相似性均達到99%。上述結果表明，MDV分離株HNGS206(p6)和HNXZ103(p11)病毒基因組中確實存在REV-LTR的重組。

2.3MDV分離株中REVgag和pol基因的RT-PCR

為探討這兩個MDV分離株病毒基因組中REV-LTR重組是自然攜帶的還是共感染培養引起的，對HNGS101等MDV河南分離株最高代次病毒感染的CEF細胞RNA分別進行REVgag和pol基因的RT-PCR擴增，結果顯示僅有分離株HNGS206(p6)、HNXZ103(p11)和陽性對照HA9901中擴增出了與預期大小相符的RT-PCR產物(圖1C和1D)，表明這兩個MDV河南分離株中可能存在REV。

2.4MDV分離株中REV的IFA檢測

為了進一步確證MDV河南分離株中是否混合感染了REV，分別用HNGS101等河南分離株的最高代次病毒接種CEF細胞并進行IFA檢測。結果顯示，MDV河南分離株感染的CEF細胞全部呈現MDV gB蛋白單抗BA4的特異性病毒蝕斑熒光染色，僅有兩個分離株HNGS206(p6)和HNXZ103(p11)感染的CEF細胞呈現REV gE蛋白單抗11B118特異性熒光染色，未接毒CEF細胞對照均為陰性(圖2)。上述結果表明，在17個MDV河南分離株中，HNGS206和HNXZ103中確實存在REV的共感染。

2.5MDV分離株中REV共感染及LTR重組的溯源分析

為了追溯HNGS206和HNXZ103中REV的共感染及LTR重組的來源，對這兩個毒株不同代次病毒均進行了REV的gag和pol基因的RT-PCR擴增以及IFA檢測。RT-PCR產物的電泳分析結果顯示，分離株HNGS206的p2～p3代病毒RT-PCR均為陰性、但p4～p6代病毒均為陽性，而分離株HNXZ103的p3～p11代病毒RT-PCR均為陽性(圖3A和3B)，與上述對HNGS206或HNXZ103各不同代次病毒進行的REV IFA結果一致。對用于MDV分離傳代培養的各批次CEF陰性細胞進行的同步檢測結果表明，gag和pol基因的RT-PCR及REV IFA結果均為陰性，因此排除了在病毒傳代培養過程中人為污染REV的可能性。上述分析結果表明，MDV分離株HNGS206和HNXZ103中的REV來源于臨床病例雞的兩種病毒的混合感染。進一步對這兩個MDV分離株的不同代次病毒DNA進行REV-LTR PCR擴增的結果顯示，HNGS206的p4～p6代和HNXZ103的p3～p11代LTR均為陽性(圖3C)，表明在MDV分離后傳代培養至第3～4代，MDV和REV即發生了基因重組。

3討論

近年來，MDV流行毒株的毒力不斷增強，目前國外已分離鑒定了多株超超強的MDV毒株(very virulent plus MDV，vv+MDV)，促使MDV毒力不斷增強的最主要因素可能與MDV疫苗的廣泛使用及免疫壓力有關。MDV與REV的混合感染是導致免疫失敗的重要因素之一[24]。已有研究證實，MDV和REV的體外共培養可導致兩種病毒的基因重組[8-10]，國內學者崔治中等研究發現，MDV—REV的重組野毒株GX0101在病毒基因組重組插入LTR片段后，其致病性雖然有所降低，但其水平傳播力卻有所增強[13，17-18]。國外多項研究也表明，基于REV-LTR整合位點的不同，其引起MDV的致病性、復制力、水平傳播能力等病原學特性也有差異[8-10，14-16]。因此，進一步深入研究MDV和REV的體外重組及流行病學情況，對于今后有效防控MD具有重要意義。

為了解國內雞群中MDV—REV共感染及重組毒株的流行情況，本研究對此前分離自河南不同地區雞群的17個MDV野毒流行株進行分析，結果發現這17個MDV分離株中有2個毒株HNGS206和HNXZ103的病毒基因組中存在REV-LTR的重組。對HNGS206和HNXZ103各不同代次培養病毒進一步的溯源研究發現，這種基因重組最初極有可能是因為在臨床病例雞體內就已經發生MDV和REV的混合感染。作者進一步研究的結果證實，隨著后續病毒分離培養及傳代3～4代，兩種病毒進而發生了LTR的基因重組，這種體外重組與國外相關學者的研究基本一致[8，11-12]。稍顯遺憾的是，在最初病毒分離時，本研究未能同步保存病例雞的血樣或臟器樣本。若能對原始病料的病理組織切片進行MDV和REV混合共感染IFA或PCR檢測，將更有助于兩種病毒基因重組的溯源分析，這是后續相關研究需要進一步改善的。

鑒于國內外雞群REV與MDV混合感染的普遍性，很多研究人員正致力于研發可針對兩種病毒的二價疫苗或重組疫苗。B.Lupiani等成功將REV—LTR插入CVI988疫苗株的病毒基因組中，該重組疫苗已被證實在細胞培養中的生長率及免疫保護力均有一定程度的提高[25]。盡管如此，由于目前MDV和REV重組的生物學意義尚不明確，此類疫苗的臨床使用，仍將存在著促進兩種病毒體外重組及大面積流行的巨大隱患。根據本研究的結果，MDV—REV重組毒株可能只是來源于宿主體內的混合感染及病毒分離培養，而非自然界存在的自然重組毒株的廣泛流行。此前研究發現，LTR內的啟動子和增強子很可能會改變MDV基因組插入位點附近的基因表達[14]，REV也可能通過MDV來幫助自身的傳播，這可能帶來嚴重后果。與MDV不同，REV除水平傳播外還可以垂直傳播，REV序列的重組很可能拓寬MDV的傳播途徑，從而加速其流行并帶來難以估計的損失[26]。總之，MDV與REV的混合感染及基因重組對于MDV的病原學特性及致病性的影響仍有待進一步的深入研究，因此繼續加強MDV的流行病學監測對該病的有效防控至關重要。

4結論

從17個MDV分離株中，分析鑒定了兩個基因重組毒株HNGS206和HNXZ103，這兩株病毒基因組中均存在REV-LTR基因片段的插入。進一步的溯源研究結果發現，HNGS206和HNXZ103并非MDV與REV的自然重組毒株，REV-LTR的重組可能發生于兩種病毒共感染宿主后的病毒分離培養及細胞傳代過程中。國內雞群是否存在MDV自然重組毒株的流行仍需要進一步的流行病學監測。

參考文獻(References)：

[1]DAVISON A J，EBERLE R，EHLERS B，et al.The order Herpesvirales[J].ArchVirol，2009，154(1)：171-177.

[2]WITTER R L，SCHAT K.Marek’s disease[M]//Diseases of Poultry.11th.Ames：Iowa State University Press，2003：407-464.

[3]CHURCHILL A E，PAYNE L N，CHUBB R C.Immunization against Marek’s disease using a live attenuated virus[J].Nature，1969，221(5182)：744-747.

[4]BUCHEN-OSMOND.Reticuloendotheliosis virus (strain T，A)[DB]//Büchen-Osmond(ed.).The Universal Virus Database，version 3.ICTVdB vol.ICTVdB-Management.New York：Columbia University，2004：421-440.

[5]WITTER R L，SCHAT K.Neoplastic diseases：Reticuloendotheliosis[M]//Diseases of poultry.12th.Ames：Iowa State University Press，2008：515-529.

[6]YUASA N，YOSHIDA I，TANIGUCHI T.Isolation of a reticuloendotheliosis virus from chickens inoculated with Marek’s disease vaccine[J].NatlInstAnimHealthQ(Tokyo)，1976，16(4)：141-151.

[7]LI J，YANG C，LI Q，et al.Complete genome sequence of reticuloendotheliosis virus strain MD-2，isolated from a contaminated Turkey herpesvirus vaccine[J].GenomeAnnounc，2013，1(5)：e00785-13.

[8]ISFORT R，JONES D，KOST R，et al.Retrovirus insertion into herpesvirusinvitroandinvivo[J].ProcNtalAcadSciUSA，1992，89(3)：991-995.

[9]JONES D，ISFORT R，WITTER R，et al.Retroviral insertions into a herpesvirus are clustered at the junctions of the short repeat and short unique sequences[J].ProcNatlAcadSciUSA，1993，90(9)：3855-3859.

[10]ISFORT R J，QIAN Z，JONES D，et al.Integration of multiple chicken retroviruses into multiple chicken herpesviruses：herpesviral gD as a common target of integration[J].Virology，1994，203(1)：125-133.

[11]DAVIDSON I，BORENSHTAIN R.Invivoevents of retroviral long terminal repeat integration into Marek’s disease virus in commercial poultry：Detection of chimeric molecules as a marker[J].AvianDis，2001，45(1)：102-121.

[12]WOZNIAKOWSKI G，SAMOREK-SALAMONOWICZ E，KOZDRUN W.Molecular characteristics of Polish field strains of Marek’s disease herpesvirus isolated from vaccinated chickens[J].ActaVetScand，2011，53：10.

[13]ZHANG Z，CUI Z.Isolation of recombinant field strains of Marek’s disease virus integrated with reticuloendotheliosis virus genome fragments[J].SciChinaCLifeSci，2005，48(1)：81-88.

[14]JONES D，BRUNOVSKIS P，WITTER R，et al.Retroviral insertional activation in a herpesvirus：transcriptional activation of US genes by an integrated long terminal repeat in a Marek’s disease virus clone[J].JVirol，1996，70(4)：2460-2467.

[15]KOST R，JONES D，ISFORT R，et al.Retrovirus insertion into herpesvirus：characterization of a Marek’s disease virus harboring a solo LTR[J].Virology，1993，192(1)：161-169.

[16]KIM T，MAYS J，FADLY A，et al.Artificially inserting a reticuloendotheliosis virus long terminal repeat into a bacterial artificial chromosome clone of Marek’s disease virus (MDV) alters expression of nearby MDV genes[J].VirusGenes，2011，42(3)：369-376.

[17]CUI Z，ZHUANG G，XU X，et al.Molecular and biological characterization of a Marek’s disease virus field strain with reticuloendotheliosis virus LTR insert[J].VirusGenes，2010，40(2)：236-243.

[18]SUN A J，XU X Y，PETHERBRIDGE L，et al.Functional evaluation of the role of reticuloendotheliosis virus long terminal repeat (LTR) integrated into the genome of a field strain of Marek’s disease virus[J].Virology，2010，397(2)：270-276.

[19]禹樂樂，滕蔓，羅俊，等.河南商品蛋雞群中雞馬立克氏病的流行病學研究[J].華北農學報，2012，27(6)：163-166.

YU L L，TENG M，LUO J，et al.Epidemiology of Marek’s disease in commercial layer chickens in Henan province[J].ActaAgriculturaeBoreali-Sinica，2012，27(6)：163-166.(in Chinese)

[20]宿靖偉，羅俊，王新衛，等.河南雞群馬立克氏病病毒流行毒株的分子進化分析[J].華北農學報，2015，30(1)：130-136.SU J W，LUO J，WANG X W，et al.Evolutionary analysis of field Marek’s disease virus prevalent in chicken flocks in Henan province[J].ActaAgriculturaeBoreali-Sinica，2015，30(1)：130-136.(in Chinese)[21]YU Z H，TENG M，LUO J，et al.Molecular characteristics and evolutionary analysis of field Marek’s disease virus prevalent in vaccinated chicken flocks in recent years in China[J].VirusGenes，2013，47(2)：282-291.

[22]SU S，CUI N，CUI Z，et al.Complete genome sequence of a recombinant Marek’s disease virus field strain with one reticuloendotheliosis virus long terminal repeat insert[J].JVirol，2012，86(24)：13818-13819.

[23]WANG Y，CUI Z，JIANG S.Sequence analysis for the complete proviral genome of reticuloendotheliosis virus Chinese strain HA9901[J].SciChinaCLifeSci，2006，49(2)：149-157.

[24]MILES A M，REDDY S M，MORGAN R W.Coinfection of specific-pathogen-free chickens with Marek’s disease virus (MDV) and chicken infectious anemia virus：effect of MDV pathotype[J].AvianDis，2001，45(1)：9-18.

[25]LUPIANI B，LEE L F，KREAGER K S，et al.Insertion of reticuloendotheliosis virus long terminal repeat into the genome of CVI988 strain of Marek’s disease virus results in enhanced growth and protection[J].AvianDis，2013，57(2 Suppl)：427-431.

[26]ISFORT R J，WITTER R，KUNG H J.Retrovirus insertion into herpesviruses[J].TrendsMicrobiol，1994，2(5)：174-177.

(編輯白永平)

Co-infection of Field Marek’s Disease Virus with Reticuloendotheliosis Virus Prevalent in Vaccinated Chicken Flocks

SU Jing-wei1，2，TENG Man1，LUO Jun1，3*，CHI Jia-qi1，YU Zu-hua3，YU Le-le1，HU Bo1，ZHANG Gai-ping1，2*

(1.KeyLaboratoryofAnimalImmunologyoftheMinistryofAgriculture，HenanProvincialKeyLaboratoryofAnimalImmunology，HenanAcademyofAgriculturalSciences，Zhengzhou450002，China；2.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China；3.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandPublicSafety，CollegeofAnimalScienceandTechnology，HenanUniversityofScienceandTechnology，Luoyang471003，China)

Key words:MDV；REV；epidemiology；co-infection；virus passage；gene recombination

Abstract:This study was performed to investigate the co-infection and natural recombination of Marek’s disease virus (MDV) and reticuloendotheliosis virus (REV) in chicken flocks in China，and evaluate the potential influences of viral recombination on MDV biology.Based on polymerase chain reaction (PCR)，DNA sequencing and indirect immunofluorescent assay (IFA)，we presently studied a total of 17 MDV field isolates obtained from the vaccinated chicken flocks in Henan province.The PCR results showed that，among the 17 Henan isolates，two isolates，HNGS206 and HNXZ103，are recombinant MDVs containing the REV-LTR inserts.Subsequent experiments showed that neither of the two isolates are natural recombinant viruses and the integrations of LTR into the viral genomes may result from the clinical co-infection and/or virus isolation procedure.Our data indicates that although a wide-spread co-infection of both MDV and REV exists in chicken flocks in China，the epidemiology of the naturally occurring recombinant MDVs needs to be further monitored.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.017

收稿日期：2015-03-23

基金項目：國家自然科學基金(31372445)；NSFC-廣東省政府聯合基金(U1131005)；河南省農業科學院優秀青年科技基金(2013YQ28)

作者簡介：宿靖偉(1989-)，女，河南商丘人，碩士生，主要從事病毒分子生物學研究，Tel：0371-65756056，E-mail：sujingwei426@163.com *通信作者：羅俊，E-mail：luojun593@aliyun.com；張改平，E-mail：zhanggaiping2003@163.com

中圖分類號：S858.315.3

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)01-0128-07