梅花鹿致敏與休眠鹿茸干細胞差異蛋白表達的2D-DIGE分析

董　振，王權威，劉　振，孫紅梅，李春義

(中國農業科學院特產研究所，特種動物分子生物學國家重點實驗室，長春 130112)

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梅花鹿致敏與休眠鹿茸干細胞差異蛋白表達的2D-DIGE分析

董振，王權威，劉振，孫紅梅，李春義*

(中國農業科學院特產研究所，特種動物分子生物學國家重點實驗室，長春 130112)

摘要：旨在對梅花鹿(Cervusnippon)致敏鹿茸干細胞與休眠鹿茸干細胞表達蛋白進行差異篩選、鑒定及生物信息分析，為深入探討鹿茸獨特的再生分子調節機制奠定基礎。本研究采用雙向熒光差異凝膠電泳(Two-dimensional fluorescence difference in gel electrophoresis，2D-DIGE)分離蛋白樣品；利用DeCyder 7.2 分析軟件對2D-DIGE圖像進行統計學分析尋找差異表達蛋白；利用MALDI-TOF-MS (Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight tandem mass spectrometry)鑒定差異蛋白，通過Mascot 軟件搜索NCBInr 數據庫尋找匹配的蛋白；采用PANTHER (Protein Analysis Through Evolutionary Relationships) 軟件對差異蛋白進行聚類分析，REACTOME數據庫分析差異蛋白所參與的信號通路。結果得到了致敏鹿茸干細胞與休眠鹿茸干細胞2D-DIGE圖譜，致敏鹿茸干細胞與休眠鹿茸干細胞蛋白豐度相比較，比值≥1.1倍以及比值≤-1.1倍(P<0.05)的差異蛋白點有159個，其中110個上調表達，49個下調表達，EDA(Extended data analysis)分析得到了多個Marker蛋白，質譜鑒定了84 個差異蛋白質點，48個為陽性結果，共來自27 種蛋白質。并對已鑒定蛋白進行了GO分析以及信號通路富集分析。致敏鹿茸干細胞與休眠鹿茸干細胞蛋白差異明顯，質譜鑒定獲得了來自多種可能與鹿茸再生相關的差異蛋白。由此可知，鹿茸再生是鹿茸干細胞從休眠到致敏的轉化過程，需要多種蛋白分子以及信號通路的綜合調控。

關鍵詞：鹿茸干細胞；再生；蛋白質組學；2D-DIGE

近年來，再生生物學尤其是割處再生 (Epimorphic regeneration) 是生命科學研究的重點領域，鹿茸是迄今為止所發現的唯一一個可以割處完全再生的哺乳動物附屬器官。以鹿茸為模型深入研究其獨特再生分子調節機制對于揭開哺乳動物器官再生之謎具有重要意義[1]。鹿茸是以年為周期而再生的[2-3]，春天鹿角從角柄脫落隨即引發新一輪鹿茸再生；夏天，由茸皮覆蓋的新生鹿茸迅速生長；進入秋天，成熟的鹿茸便會快速骨化并伴隨茸皮脫落；到了冬天，骨化的鹿角會與角柄緊密相連從而等待新一輪鹿茸再生過程。在再生周期中，鹿茸可在短短幾個月內完成生長發育[4]，這一過程需要強大的血管營養供給系統才能輔助完成[5-6]。鹿茸具有遠超癌細胞分裂速度的生長速度，但并不發生癌變[7-8]。鹿茸再生組織學研究表明，其周期性再生是來源于角柄骨膜中的細胞，這些細胞具有胚胎干細胞的特性，因此被稱為鹿茸干細胞[2]。角柄高度具有種的特異性，如梅花鹿在5 cm左右[9]。C.Li等[10]發現，角柄骨膜根據與皮膚接觸的緊密程度有一個比較明顯的分界，即遠心端大約1/3部分骨膜與所包裹的皮膚是緊密接觸的；而近心端大約2/3部分骨膜與包裹皮膚連接疏松。C.Li等[11]進一步利用插膜試驗表明，僅遠心端角柄骨膜組織在與包裹皮膚相隔后仍具有再生鹿茸能力，而近心端插膜后則失去此能力。由此C.Li等將近心端骨膜與皮膚非緊密接觸部分培養得到的細胞稱為休眠鹿茸干細胞，相應的遠心端骨膜與皮膚緊密接觸部分培養所得到的細胞稱為致敏鹿茸干細胞[2]。

在鹿茸蛋白質組學方面，H.J.Park等[12]通過雙向電泳對赤鹿茸尖與血漿組織進行差異蛋白質組學研究，發現兩者相近度高達43%，結果顯示，鹿茸組織中含有一個發達的血管系統供給鹿茸快速生長的營養需求[13]，并且鹿茸中含有多種代謝酶及基因表達調控蛋白等。但這僅是針對鹿茸的蛋白質組學研究，而C.Li等[14]利用雙向電泳分別對鹿生茸區骨膜、角柄骨膜以及面部骨膜3種骨膜細胞蛋白質組進行比較，結果表明，生茸區骨膜細胞與角柄骨膜細胞中都鑒定到了大量差異蛋白，同時發現PI3K/Akt，ERK/MAPK，p38 MAPK等細胞信號通路在致敏鹿茸干細胞增殖時起關鍵作用，并在鹿茸干細胞中找到了胚胎干細胞的特異性標記物SOX2，NANOG和MYC等，從而推測鹿茸干細胞可能是一種介于成體干細胞與胚胎干細胞間的兼性干細胞。

目前對于與鹿茸再生關系密切的致敏鹿茸干細胞與休眠鹿茸干細胞的蛋白質組差異研究無人涉及。本試驗采用雙向熒光差異凝膠電泳(Two-dimensional fluorescene difference in gel electrophoresis，2D-DIGE)與MALDI-TOF-MS(Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry)對致敏鹿茸干細胞與休眠鹿茸干細胞進行差異蛋白質組研究，以期獲得一些與鹿茸再生相關的差異表達蛋白，為最終發現刺激鹿茸再生的分子奠定基礎。

1材料與方法

1.1供試材料

試驗于2014年4月在中國農業科學院特產研究所實驗鹿場進行，對1頭屠宰后的梅花鹿(Cervusnippon)采集了角柄骨膜。利用冰盒將骨膜帶回實驗室進行細胞培養，鹿茸干細胞取材與培養方法見參考文獻[14]，將培養后收獲的細胞于液氮中保存備用。

1.2蛋白質樣品的準備

細胞培養瓶中將培養好的致敏鹿茸干細胞與休眠鹿茸干細胞棄去培養液，用山梨醇(Sigma-Aldrich公司)細胞清洗液清洗2次后收集細胞。再用山梨醇細胞清洗液懸浮洗滌細胞3次，每次懸浮后1 000 r·min-1離心5 min，并再次加入山梨醇細胞清洗液，最后1次加入500 μL自制裂解液(7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲，4% CHAPS和1% 蛋白酶抑制劑)。之后將得到的兩種細胞混合液中分別加入等量直徑為0.5 mm的不銹鋼珠并利用Bullet Blender 細胞組織破碎儀對細胞進行破碎，之后，將其放在冰盒中震蕩4 h左右，隨后12 000 r·min-1離心5 min，上清便為提取得到的蛋白。用Bradford法對蛋白樣品進行濃度測定，并將含有蛋白的上清液100 μL·管-1分裝后于-80 ℃凍存備用。

1.32D-DIGE

2D-DIGE具體操作參照丁新倫等的方法[15]，與其操作不同的地方：利用Bio-Rad公司的2D Cleanup試劑盒按照說明書將蛋白樣品進行純化處理。采用GE 公司的CyDyeTMDIGE Fluor，minimal labeling kit對致敏鹿茸干細胞與休眠鹿茸干細胞蛋白樣品進行熒光標記，Cy3 和Cy5 分別用于標記致敏鹿茸干細胞與休眠鹿茸干細胞蛋白，Cy2 標記兩種細胞等量混合后的蛋白作為內標。第一向等電聚焦程序：S1 stp 250 V 1 h；S2 stp 500 V 1.5 h；S3 grd 1 000 V 1 h；S4 grd 4 000 V 7 000 Vh；S5 grd 8 000 V 6 750 Vh；S6 stp 8 000 V 35 000 Vh，整個聚焦過程總電壓為56 kVh。第二向SDS-PAGE：將平衡好的膠條與12.5% SDS-PAGE 凝膠緊密結合并用封膠液進行封膠，將膠板置于GE ETTAN DALTsix 電泳系統，第二向電泳的程序：S1 2 W·gel-130 min；S2 17 W·gel-1，直至溴酚藍跑到底，約4.5 h。

1.4掃描與圖像分析

利用Typhoon FLA 9500(GE公司)獲得2D-DIGE 的蛋白表達圖像，分析軟件為DeCyder 2D 7.2(GE)。整個分析使用DeCyder DIA(Difference in-gel analysis)、DeCyder BVA (Biological variation analysis)和DeCyder EDA(Extended data analysis)軟件模塊完成。每一匹配點的統計分析均采用Student’st檢驗比較致敏鹿茸干細胞與休眠鹿茸干細胞蛋白豐度的均值和標準差。并通過EDA模塊進行Marker Selection分析，即使用偏最小二乘搜索(Partial Least Squares Search)與最鄰近分類法(K-Nearest Neighbors)來鑒定兩組樣品中重要的差異蛋白。并取每組蛋白樣品500 μg，混合后按與2D-DIGE試驗相同的電泳參數進行雙向電泳，之后進行SYPRO RUBY染色，并切取在2D-DIGE膠中豐度具有顯著性改變(比值≥1.1倍以及≤-1.1倍，P<0.05)以及EDA模塊分析得到的重要蛋白質點用于質譜分析。

1.5差異蛋白質點的酶解和MALDI-TOF-MS質譜鑒定

委托北京蛋白質組研究中心進行質譜檢測。參照曹曉艷等的方法[16]，質譜檢測儀器為ABI 4800 Proteomics Analyzer MALDI-TOF/TOF。MALDI-TOF 質譜分析獲得肽指紋圖譜(Peptide mass fingerprint)數據以及MS-MS 數據，用MASCOT 軟件搜索 NCBInr 數據庫。檢索條件：胰酶解，允許最大的未被酶切位點數為1，物種來源分別為人、野牛與牛，沒有固定修飾，可變修飾 Oxidation (M)，maximum peptide rank設為10，片段離子質量容差為0.3D。MASCOT檢索蛋白質得分(P<0.05)：野牛>57分；牛>61分；人>61分。

1.6差異蛋白的生物信息分析

采用PANTHER[17](http：//www.pantherdb.org/，SRI International，Menlo Park，California，USA)對差異蛋白進行聚類分析，其主要根據蛋白分子功能、生物過程以及蛋白類別進行分類。由DAVID[18-19](http：//david.abcc.ncifcrf.gov/home.hsp)數據庫對已鑒定蛋白所參與的信號通路進行富集分析。

2結果

2.1致敏鹿茸干細胞與休眠鹿茸干細胞蛋白表達差異分析

對Typhoon掃描的致敏鹿茸干細胞與休眠鹿茸干細胞蛋白標記的2D-DIGE圖譜進行多通道疊加(圖1)。DeCyder 7.2 軟件分析每張膠平均得到約2 858 個蛋白質點(膠1：2 832個；膠2：2 805個；膠3：2 937個)，各組間凝膠上蛋白點分布模式較為一致。共選出有統計學意義(比值≥1.1以及≤-1.1倍，P<0.05)的差異蛋白質點159 個(圖 2)，其中，致敏鹿茸干細胞/休眠鹿茸干細胞蛋白表達豐度升高的點有110 個，表達豐度下降的點有49 個。圖3顯示了部分蛋白質點上調和下調蛋白的曲線圖和三維圖。通過EDA模塊Marker Selection分析得到所研究的兩種細胞中重要的Marker蛋白，這些是后續質譜分析與功能驗證的重點蛋白。

2.2差異表達蛋白MALDI-TOF-MS 鑒定

綜合DeCyder軟件BVA與EDA分析結果，從后續制備SYPRO RUBY蛋白膠中挖取84 個差異蛋白質點進行質譜分析，通過數據庫檢索成功鑒定出48 個蛋白質點，分屬27 種蛋白，有多個點經鑒定為同種蛋白，其中，12 個蛋白質點表達上調，15 個蛋白質點表達下調。表1概括了質譜鑒定差異蛋白點的相關信息。

2.3差異蛋白的生物信息學分析

從生物學過程、分子功能及蛋白分類3 方面進行PANTHER 功能分析(圖4)。圖中顯示，已鑒定的差異蛋白涉及多個生物學過程，包含生物起源、細胞代謝、定位、生殖、生物調節、刺激反應、發育過程、生物附著和免疫系統調節等；在分子功能上分屬7 類，包括核苷酸結合轉錄因子活性、連接酶活性、受體活性、酶調節活性、結構分子活性、催化活性和載體活性；在蛋白分類上，差異蛋白來自多種類別，主要有轉移/載體蛋白、細胞骨架蛋白、結構蛋白、受體蛋白、轉運蛋白、核酸結合蛋白、轉錄因子以及水解酶類等。DAVID中REACTOME 通路分析結果如圖5所示。

表1通過2D-DIGE得到的經質譜鑒定的差異表達蛋白

Table 1Differentially expressed proteins identified by mass spectrometry(MS) after 2D-DIGE analysis

3討論

梅花鹿致敏鹿茸干細胞與休眠鹿茸干細胞差異蛋白質組學研究尚未見報道。本試驗采用改進于傳統雙向電泳的熒光差異凝膠電泳技術對鹿茸干細胞進行研究。2D-DIGE技術因其靈敏度高，重復性好以及統計學可信度高等特點已成為與iTraq(Isobaric tag for relative and absolute quantitation)和SILAC(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture) 同被使用的定量蛋白質組學技術。

3.1質譜鑒定中部分多點重復蛋白與鹿茸再生的關系

POTE可編碼包含3個結構域的腫瘤睪丸抗原，并因主要在前列腺、卵巢、睪丸及胎盤中表達而得名。T.K.Bera研究發現[20]，POTE蛋白在人胚胎干細胞系中表達，尤其是POTE-2會顯著表達[21]。而本試驗中POTE (spot1430、spot641和spot398) 在休眠鹿茸干細胞中高表達，可能預示著休眠鹿茸干細胞與胚胎干細胞相似，這與C.Li等[2]研究結果一致。而研究報道[20-21]該蛋白是靈長類動物特異表達蛋白，本試驗在梅花鹿中找到了該蛋白，這表明其并不是靈長類特異表達的蛋白。

質譜數據發現，致敏鹿茸干細胞中有多個SAE1 (SUMO-activating enzyme subunit 1)(spot2433和spot1891等)蛋白高度表達，研究發現，Myc驅使的腫瘤生成依賴于SAE蛋白與SUMOylation修飾[22-23]，從而維持腫瘤發生的特征[24]。C.Li等[14]證明，在角柄骨膜細胞中存在Myc，其具有調控細胞周期、細胞增殖、腫瘤生成、細胞分化以及細胞凋亡等多重作用[22，25]，但Myc的具體生物學功能是由相應細胞微環境中參與的細胞因子所涉及的調控機制決定的[25]。由此可知，SAE1可能作為Myc的一類調控因子從而使Myc具有促使細胞快速增殖的作用，具體過程表現為當Myc因突變等而超極化后便會使細胞進行不可控的增殖甚至是腫瘤生成[24]。而SAE1不存在時，Myc驅使的細胞便會死亡。在Myc含量較高，SAE1較少時，Myc表達的細胞有更長的無轉移存活率；但是SAE1較多時，Myc表達的細胞會癌變。結合試驗結果，休眠鹿茸干細胞中SAE1相對含量較低，則表現為該細胞相對更穩定；而致敏鹿茸干細胞中SAE1較多，則Myc被激活，使得該細胞具有高度分化的特性與快速分裂增殖能力。生命體是一個平衡體，當抑癌作用高于致癌作用時，細胞便不會癌變，反之生命體便會失調致癌[24]；而鹿茸干細胞可能同樣如此，即存在抑癌調控體系，又存在致癌快速增殖體系如SAE-Myc，也許正是這些過程間的相互作用與相互制約從而使鹿茸組織既能快速生長又不癌化，具體機制有待進一步研究。

3.2生物信息學分析已鑒定的差異蛋白與鹿茸再生的關系

DAVID 信號通路富集分析表明差異蛋白主要參與止血通路與糖尿病通路。在鹿茸鋸茸過程中，其截斷面會因過大壓力而噴出血柱，如果不能快速止血，鹿將會因失血過多衰竭而死，但實際情況表明止血過程很快，所以鑒定到的蛋白可能在角柄骨膜中高度表達從而促使快速止血。而V.Stéger 研究發現，鹿茸骨組織中的糖含量要高于正常骨組織的5倍以上[26]，在正常組織中應表現為糖尿病癥狀，但對于鹿茸而言其需要大量的能量消耗來滿足自身的快速生長，所以應該有一套完善的機制對高血糖進行消耗與利用從而促進鹿茸再生。

糖尿病通路所富集的蛋白中，ALDOB(Aldolase B)參與糖代謝，并涉及糖酵解與糖異生過程[27]。ALDOB蛋白還是一種胞內胰島素結合蛋白[28]，其與胰島素結合的復合體涉及細胞生長調控，細胞分化以及蛋白質代謝等功能。所以在致敏鹿茸干細胞中ALDOB(spot295) 高表達可協助胰島素利用細胞內的糖類為細胞大量增殖與分化供能。另外，ALDOB也參與Wnt通路[29]的正調控。在動物發育最早期，Wnt通路會對某些組織的損傷進行修復并修正促進再生的相關位置信息[30]。Wnt通路也涉及鹿茸再生過程，主要針對骨再生過程中的成骨細胞[31]。所以ALDOB可能既通過直接或間接作用參與致敏鹿茸干細胞內的糖代謝作用，也可調控其Wnt通路，從而促進鹿茸再生。

GRP78 (Glucose-regulated peptide 78) 是內質網中高度表達的分子伴侶，其能夠促使蛋白正確折疊并降解錯誤折疊蛋白從而提高細胞存活率[32-33]。UPR (Unfolded protein response) 是一個當內質網腔內聚集的未折疊蛋白超過內質網折疊能力后(即內質網應激)所激活的高度保守的信號通路反應。GRP78是UPR信號出現后抑制內質網應激反應的主要調控者。GRP78主要由insulin/IGF-1通路調控來影響細胞增殖與存活，是其下游調控靶點[34]。最近研究表明，PI3K/AKT通路與GRP78蛋白互作以利于GRP78調控腫瘤生長以及阻止細胞凋亡，在腫瘤環境下，GRP78既可作為PI3K/AKT通路的下游靶點，又可作為其上游調控者。所以致敏鹿茸干細胞中GRP78(spot524) 含量較高，可能是鹿茸再生過程中內質網蛋白合成活動比較激烈，細胞分泌比較旺盛且細胞增殖速率較快從而需要大量GPR78進行調控導致的。

ITPR1 (Inositol 1，4，5-trisphosphate receptor type 1) 是一個在受三磷酸肌醇(IP3)刺激后從內質網中調控鈣離子釋放的細胞內通道，通過激活鈣調蛋白，細胞內鈣離子便會從內質網中釋放從而引發細胞凋亡，最終導致下游細胞凋亡通路的活化[35]。由此可知，ITPR1 (spot323) 在休眠鹿茸干細胞中高表達可能起監控作用，即確保細胞正確合成調節型分泌途徑的蛋白并誘導癌變細胞凋亡。ITPR1參與內質網應激的調控可能與GRP78的作用有一定的聯系，其在鹿茸干細胞中的具體作用機制有待進一步研究。

3.32D-DIGE圖譜EDA判定的Marker與鹿茸再生的關系

DeCyder軟件EDA模塊可對2D-DIGE圖譜進行統計分析從而做Marker判定，其結果相對可信。本試驗鑒定到的陽性蛋白中有4個重要蛋白排行在EDA所判定的Marker前30位，按照Marker判定排序具體如下。

3.3.1三角形四肽重復蛋白36(Tetratricopeptide repeat protein 36，HBP21)本試驗鑒定得到的HBP21(spot1243)是一個新發現的包含肽重復序列結構域(Tetratricopeptide repeat TPR)的蛋白，并能夠與Hsp70羧基端互作。HBP21幾乎在所有的惡性組織中表達，并在有腫瘤轉移的組織中高表達。HBP21可通過抑制Hsp70參與對腫瘤細胞惡化與轉移的抑制。與HBP21類似，HspBP1在細胞中大量廣泛表達，并與Hsp70親合力高且能抑制Hsp70的活性[36]。HeLa細胞中抗癌藥物(長春新堿、紫杉醇以及依托泊苷)在不影響Hsp70表達的同時誘導HspBP1在腫瘤細胞上調2.0～2.5倍，之后HspBP1特異性結合并拮抗Hsp70，因此HspBP1使腫瘤細胞更容易在組織蛋白酶調控下凋亡。

致敏鹿茸干細胞中HBP21高表達，推測其可由角柄中活性分子的激活，而拮抗Hsp70活性從而抑制細胞癌化，并促使癌化細胞凋亡。

3.3.2組蛋白 H4 (Histone H4)組蛋白折疊微區有多種翻譯后修飾，如乙酰化[37]與磷酸化[38]等。不同修飾態組蛋白能為不同染色體調控因子提供結合位點[39]。蠑螈晶狀體是通過色素上皮細胞(Pigmented epithelial cells，PECs)轉分化再生的，而去分化的PECs有類胚胎干細胞特性[40]。其中乙酰化Histone H4的增加是蠑螈PECs去分化過程中染色質調控的重要特征。

在胚胎發育中細胞內端粒會在快速增殖過程內持續縮短直到極短而激活DNA損傷通路，并最終限制細胞增殖能力。而端粒長度在斑馬魚鰭重復截斷再生過程[41-42]中維持不變甚至延長，這可解釋相關細胞所具有的高增殖分化能力。所以端粒長度維持及組織再生能力間存在直接關系。Histone H4等組蛋白表達量降低可引發由DNA損傷[43]導致的端粒功能異常。而乙酰化Histone H4的顯著減少也會限制端粒功能。說明組蛋白尤其是Histone H4表達量與修飾狀態可調控端粒功能。

本試驗中，與致敏鹿茸干細胞相比休眠鹿茸干細胞中Histone H4(spot1360)的含量更高，說明該細胞可能與胚胎干細胞相近并可能存在較大再生潛力。而致敏鹿茸干細胞中Histone H4下調，細胞大量增殖分化導致端粒縮短。

3.3.3ATP合成酶beta亞基 (ATP synthase subunit beta，ATP5B)ATP合成酶在線粒體中涉及氧化能量代謝并對細胞功能的發揮起重要作用[44]。ATP5B是催化真核細胞ATP合成過程的限速步驟[45]。

由本試驗結果可知，ATP5B(spot1331)在致敏鹿茸干細胞中高表達，即致敏鹿茸干細胞需進行更多的氧化能量代謝以支撐其快速增殖與分化等；但休眠鹿茸干細胞相對穩定，不需過多能量消耗。

3.3.4波形蛋白(Vimentin)本試驗中得到的波形蛋白 (spot1133) 是主要存在于間充質細胞中的第3類中間纖維[46]，是細胞骨架以及核被膜的主要成分。在成體組織中波形蛋白[47]是唯一能夠在不同細胞類型中表達的中間纖維。在組織培養中，波形蛋白缺乏的成纖維細胞有異常的actin細胞骨架結構。另外，波形蛋白缺乏的成纖維細胞機械穩定性、運動性以及定向遷移能力會減弱[48]。在(去)分化、胚胎發育及腫瘤形成過程中，波形蛋白均起到重要作用。其在上皮間質轉化(EMT，epithelial-mesenchymal transition)過程中被快速誘導表達。EMT在胚胎發育和傷口愈合等生理過程以及癌癥侵襲、轉移等病理過程中發揮重要作用，而波形蛋白在EMT中起關鍵作用[49-50]。

與體外培養的牙髓總細胞相比，在CD105陽性牙髓干細胞中波形蛋白的mRNA與蛋白均高表達。因此盡管波形蛋白不是牙髓特異性表達的，但它可作為牙髓再生的質量評價標準。體外培養的CD105陽性牙髓干細胞中敲除波形蛋白基因后細胞遷移活動會明顯降低，表明波形蛋白在再生牙髓組織中表達可促使牙髓干細胞的遷移從而促進再生[51]。

由上可知，在鹿茸再生過程中，致敏鹿茸干細胞中波形蛋白高表達表明其具有更好的遷移性從而能較快的進行增殖與分化；而休眠鹿茸干細胞的運動性較差，穩定性較高。且波形蛋白可能對兩種細胞actin的差異表達有一定影響。

3.4本研究蛋白鑒定結果的不足

本試驗中，部分差異點由于凝膠點較淡，蛋白表達量過少或實際蛋白質與理論推斷的蛋白質分子量和等電點不符等因素導致未被質譜鑒定出來。與此同時，由于目前沒有梅花鹿的全基因組，導致缺乏特異數據庫，從而只能選擇物種相近數據庫，這便使得數據庫針對性較差，不能獲得更準確的結果并出現假陰性，最終質譜陽性鑒定率下降。而所得數據中，actin、POTEE以及keratin等蛋白出現了多點重復鑒定，在蛋白圖譜中這些蛋白點分離清晰、相距不遠、具有不同的等電點，可能是其發生了磷酸化、甲基化或乙酰化等修飾。

綜上表明，鹿茸再生是一個鹿茸干細胞從休眠到致敏的轉化過程，這個過程需要多種蛋白分子參與以及信號通路網絡的綜合調控。

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(編輯郭云雁)

Analysis of Differentially Expressed Proteins in the Potentiated and Dormant Antler Stem Cells through 2D-DIGE

DONG Zhen，WANG Quan-wei，LIU Zhen，SUN Hong-mei，LI Chun-yi*

(StateKeyLaboratoryforMolecularBiologyofSpecialAnimals，InstituteofSpecialAnimalandPlantSciences，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Changchun130112，China)

Key words:antler stem cell；regeneration；proteomics；2D-DIGE

Abstract:The objective of this study was to screen，identify and analyze the differentially expressed proteins in the potentiated and dormant antler stem cells in sika deer (Cervusnippon)，and then to shed lights on the molecular mechanisms underlying antler regeneration.The two-dimensional fluorescence of gel electrophoresis (2D-DIGE) was used to separate the protein spots；Differentially expressed protein spots were selected by DeCyder 2D (version 7.2)；Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight tandem mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) was carried out to obtain peptide mass fingerprinting，Mascot software was used to search the matched proteins in the NCBInr database；PANTHER (Protein Analysis Through Evolutionary Relationships) and REACTOME analysis were performed to further explore the involved signal pathways about these identified proteins.The proteomic profile of the potentiated antler stem cells compared with the dormant antler stem cells was explored by 2D-DIGE.One hundred fifty-nine protein spots with more than 1.1-fold changes and less than -1.1-fold changes andPvalues less than 0.05 differentially expressed by the potentiated over the dormant antler stem cells，including 110 up-regulated and 49 down-regulated protein spots.Multiple markers were obtained by extended data analysis(EDA) module.MALDI-TOF-MS identified 84 differentially expressed protein spots and 48 of them which came from 27 kinds of proteins were positive.There is a significant difference at proteomic level between the potentiated and the dormant antler stem cells，and some identified proteins which are involved in multiple functional categories might be related to antler regeneration.Therefore，antler regeneration is a process from the dormant to the potentiated states in antler stem cells，which is regulated by multiple proteins and a complicated signal network.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.013

收稿日期：2015-02-04

基金項目：國家高技術研究發展計劃(863)項目(2011AA100603)；國家自然科學基金項目(31170950)；吉林省重點科技攻關項目(20150204071NY)；吉林省自然科學基金項目(20140101139JC)

作者簡介：董振(1989-)，男，吉林白城人，碩士生，主要從事鹿茸蛋白質組學研究，E-mail：xi.andz@163.com *通信作者：李春義，博士，研究員，主要從事鹿茸生物學研究，E-mail：lichunyi1959@163.com

中圖分類號：S825；S813.3

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)01-0092-13