牦牛卵巢小RNA高通量測序及生物信息學分析

熊顯榮，蘭道亮，2，李　鍵，2*，字向東，林亞秋，馬　力

(1.西南民族大學生命科學與技術學院，成都 610041； 2.西南民族大學青藏高原研究院，成都 610041)

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牦牛卵巢小RNA高通量測序及生物信息學分析

熊顯榮1，蘭道亮1，2，李鍵1，2*，字向東1，林亞秋1，馬力1

(1.西南民族大學生命科學與技術學院，成都 610041； 2.西南民族大學青藏高原研究院，成都 610041)

摘要：本研究旨在利用高通量測序技術描繪牦牛卵巢sRNA圖譜，為探析牦牛繁殖性能提供基礎。以牦牛卵巢組織作為研究對象，構建牦牛sRNA文庫，進行高通量測序和生物信息學分析，最后利用RT-qPCR技術驗證miRNA在牦牛卵巢組織中的表達。經測序后得到包含12 126 208 條clean reads，其中特異序列為212 757條；比對分析顯示，只有7 383 536 (60.89%) 條總序列及80 981(38.06%) 條特異序列能與牦牛基因組匹配。與黃牛相比，牦牛sRNA中有56個表達量上調，其中miR-135a表達上調最顯著；有33個表達下調，其中miR-2316表達下調最顯著。RT-qPCR驗證6個miRNA在牦牛卵巢組織中的表達情況，定量結果和測序結果基本一致。與牦牛EST序列信息比對后共預測出5個新miRNA。本研究成功繪制牦牛卵巢sRNA圖譜，同時證實RNA-Seq高通量測序技術在完善sRNA信息及挖掘新miRNA方面的優勢，對研究sRNA在牦牛遺傳育種以及以牦牛為重要高原動物模型來進行高原適應性和抗逆性等相關領域的研究具有重要意義。

關鍵詞：牦牛；卵巢；高通量測序；小RNA；生物信息學

牦牛被稱作高原之舟，主要分布在中國青藏高原及其毗鄰的高山、亞高山地區。在長期的自然選擇和人工選擇的共同作用下，牦牛對高海拔、低溫、低氧牧區具有良好適應性，能充分利用高寒草場資源。牦牛是當地牧民賴以生存和發展的生產、生活資料，也是牧區經濟的支柱產業和牧民經濟收入的主要來源[1]。但與普通牛種相比，牦牛生長速度慢、性成熟較晚，而且繁殖性能低，成為高原畜牧業發展及生態保護的主要瓶頸之一。近期牦牛基因組的測序工作基本完成[2]，為下一步開展保護牦牛遺傳資源、提高牦牛生產性能、研究牦牛生長發育及探析繁殖性能等諸多方面工作提供可靠的依據。

小分子RNA(Small RNA，sRNA)是一類長20～30核苷酸(Nucleotide，nt)的非編碼RNA分子。sRNA最初在秀麗線蟲中發現，且廣泛存在于真核生物中，是重要的轉錄后調控因子[3-4]。大量研究表明小RNA具有廣泛的生物學功能，對個體發育調控、細胞分化、胚胎發育等生物過程起重要作用[5-6]。sRNA主要是通過抑制靶基因翻譯或者是直接降解靶基因mRNA達到調控基因表達，由此可知sRNA對大多數的靶基因都是起負調控作用。鑒于sRNA的生物學重要性，準確鑒定其序列及表達時空性是當務之急。然而sRNA序列短、同源性高，因此利用傳統的克隆法、基因芯片技術等檢測sRNA非常困難。此外，sRNA的數量巨大，相應的工作較復雜、費用高、效率低等；再次假陽性高、靈敏度低、速度慢，難以發現低表達量和低拷貝的新sRNA。隨著測序技術的快速發展，高通量測序技術相繼誕生并逐漸成熟。高通量測序技術不但能夠克服以上難題，而且在發現新的sRNA上具有顯著優勢。目前高通量測序技術已經成功的應用于擬南芥[7]、水稻[8]、小麥[9]、黑猩猩[10]、人[11]等生物sRNA的研究。

目前有關sRNA生物學作用的研究不斷深入，表明其在動植物生長發育、細胞死亡、細胞分化和應答外界脅迫等方面具有重要功能[5，12-14]，并在生物合成和功能研究方面取得了一定的研究進展[15]，但在高原動植物上的相關報道較少。因此，本研究利用新二代的高通量測序技術，對牦牛卵巢sRNA文庫進行測序并做了相關的生物信息學分析，以期反映高通量測序技術在加速高原動物sRNA的發現、促進高原動物sRNA的功能研究以及提高人們對動物sRNA進化的認識等優勢。此外，為深入研究sRNA在參與調節卵泡生成及排卵過程中所起作用提供基礎性工作，對研究sRNA在牦牛遺傳育種以及以牦牛為重要高原動物模型來進行高原適應性和抗逆性等相關領域的研究具有重要意義。

1材料與方法

1.1樣品采集

從四川紅原縣屠宰場隨機選取5頭年齡、個體、體質基本一致的成年(約3周歲)麥洼母牦牛，屠宰后立即采集卵巢，用生理鹽水沖洗干凈，液氮速凍后，存于-80 ℃備用，用于總 RNA的提取。用同樣的方法，在成都青白江屠宰場選取5頭健康的成年黃牛(約3周歲)的卵巢，作為對照組。

1.2總RNA提取

參照Invitrogen公司的Trizol法分別提取5頭牦牛卵巢組織的總RNA，為保證RNA的純度，向各RNA樣本中加入適量的DNase I (Invitrogen，USA)，37 ℃孵育10 min，然后各取2 μg混合均勻組成一個RNA樣品池(Sample pool)。通過Nanodrop ND-1000 (LabTech，USA) 檢測RNA的濃度和質量。

1.3小RNA文庫的構建及Illumina-Solexa 高通量測序

采用Ambion公司SOLiD Small RNA Expression試劑盒構建牦牛卵巢的sRNA文庫。首先，sRNA在連接酶的作用下加5′和3′接頭，然后將其反轉錄成cDNA。向cDNA中加入適量的RNase用于消除未被轉錄的RNA。為了獲得足夠的高質量cDNA，進行PCR擴增得到測序文庫。構建好的文庫用2100 Bioanalyzer (Agilent)和Nanodrop ND-1000進行質量和濃度的檢測，然后送深圳華大基因公司測序。

1.4小RNA測序數據處理與分析

測序所得的數據(Raw reads)經除去接頭序列、空讀序列以及低質量序列(Phred quality < 5)后得到純凈序列(Clean reads)。使用SOAPaligner/SOAP 2.0軟件將序列比對到牦牛基因組，統計reads在參考基因組及基因序列上的分布情況及覆蓋度，與牦牛基因組至少有3次匹配的reads作為潛在的sRNA及進一步分析。

將sRNA序列與GenBank數據庫及Sanger中心的Rfam數據庫中的ncRNA (非編碼RNA)分別進行比對，識別sRNA序列中的rRNA、tRNA、snRNA等ncRNA；與miRNA數據庫(miRBase)中的miRNA進行比對，鑒定樣品中的已知miRNA；通過片段互相比對，確定與重復序列相關的siRNA；與外顯子、內含子的比對鑒定mRNA降解片段。按照優先級(rRNA等>已知miRNA>重復序列>外顯子>內含子)，應用WEGO程序對這些sRNA涉及的主要生物學功能進行GO分類注釋。將未獲得注釋的sRNA作為潛在的新miRNA，利用Mireap和miRanda對這些sRNA進行預測，預測其二級結構、酶切位點以及靶基因等，具體分析流程見圖1。通過比對結果統計測序序列的分布情況及頻率，同時利用RPKM法計算miRNA的表達量。

1.5小RNA表達的驗證

采用RT-qPCR法對高通量測序部分sRNA的表達結果進行驗證。利用Ambion mirVanaTMKit試劑盒取提總RNA，RNase-free DNase I去除基因組DNA，然后根據成熟miRNA的序列設計引物，以18S rRNA為內參進行RT-qPCR。采用Stratagene公司的High-Specificity miRNA RT-qPCR Detection Kit試劑盒及CFX96 Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad，USA)。所有定量PCR反應均重復3次，65～95 ℃每隔0.5 ℃讀板1次，繪制熔解曲線。檢測結果采用表達量差異△△Ct法對目的sRNA表達水平進行相對定量分析。

1.6miRNA靶位點的預測及其功能分類

通過miRNA序列與牦牛已公布EST的比對，預測潛在的miRNA靶位點，具體方法參照文獻[16-17]。預測遵循miRNA與靶基因錯配不超過4個堿基、相鄰堿基不錯配等原則。然后將預測的所有靶基因進行GO注釋分析，預測其可能參與的生物學過程和功能，進行相應分類及統計。

1.7統計與分析

所有組別的試驗至少重復3次，SPSS13.0進行ONEWAY ANOVA檢驗，用SSR法進行多重比較，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2結果

2.1牦牛小RNA

為了獲得牦牛小RNA，構建了牦牛卵巢sRNA文庫，并用高通量測序技術進行測序。去除接頭并濾去低質量數據后，獲得長度分布在16～30 nt的大量牦牛sRNA序列，其中以22 nt的序列居多，是由Dicer酶途徑產生的sRNA的典型長度，具有一定的保守性(圖2)。去掉小于18 nt的序列后，最

終獲得12 126 208條純凈序列(表1)，其中特異序列的數目為 212 757 條。經SOAP 軟件將這些sRNA與牦牛、黃牛基因組比對后，其中只有7 383 536 (60.89%)的總序列及80 981(38.06%) 的特異序列能匹配牦牛基因組。將牦牛sRNA與GenBank、Rfam、miRBase進行多重比對，最后依次注釋(圖3，表2)。由于牦牛全基因組序列的不夠完全，約69%的sRNA序列未能注釋。所注釋的sRNA中，rRNA最多，占總數的13.4%，其次是外顯子正義(5.8%)、內含子正義(3.23%)、tRNA (3.27%)，其余都只占很少一部分。

2.2miRNA的分析

為了尋找牦牛卵巢中的已知miRNA，將牦牛sRNA與miRBase中的miRNA進行比對發現，總共有9 161 081條能匹配，其中5 035條特異序列與牦牛miRNA有同源性(表2)。表達豐度差異分析后發現，在牦牛sRNA中有56個miRNA表達量比黃牛顯著上調，有33個miRNA表達顯著下調(圖4)。其中miR-135a表達上調極顯著(P<0.01)，miR-2316表達下調極顯著(P<0.01)。

表1黃牛與牦牛小RNA測序數據處理及片段長度分布統計

Table 1Summary of data cleaning and distribution of tags produced by yak and cattle small RNA sequencing

表2牦牛sRNA注釋結果

Table 2Annotation of yak small RNAs

2.3新miRNA的預測與分析

miRNA初始轉錄位點多位于基因間隔區、內含子以及編碼序列的反向重復序列上，其前體具有標志性的發夾結構，成熟體的形成是由Dicer酶的剪切實現的。利用這一顯著特征通過Mireap軟件來預測新的miRNA。初步預測結果顯示，共發現27條候選miRNA，并且這些候選miRNA首位堿基具有一定的偏向性(圖5)。利用牦牛EST序列信息進行牦牛新miRNA預測，共預測出5個miRNA (依次命名為new miRNA1、new miRNA2、new miRNA3、new miRNA4和new miRNA5)，但其表達量都較低(表3)。

2.4已知miRNA的表達模式

為了進一步驗證高通量測序所獲得的結果，隨機選擇6個表達量較高的miRNA，利用RT-qPCR檢測其在牦牛卵巢中的表達情況。結果顯示與高通量測序結果基本吻合(圖6)，由此表明本次高通量測序結果準確性較高，可信度大。

2.5miRNA的潛在靶位點及功能分類

為了進一步深入研究miRNA在牦牛卵巢中的生物學功能，通過與已公布的牦牛EST序列比對，預測潛在的miRNA靶位點。結果顯示，已知的保守miRNA共預測出1 403個潛在靶基因，3 501個靶位點。如圖7所示，這些潛在靶基因涉及較廣的生物學過程及功能，涉及生物學過程(Biological processes)、細胞組分(Cellular components)及分子功能(Molecular functions)3大類共47個小類。由于牦牛EST數據的有限，未能對預測出的5個新miRNA進行潛在靶位點分析。

表3利用牦牛EST 序列預測的新 miRNA

Table 3The novel miRNAs prediction with yak EST sequences

3討論

3.1牦牛卵巢sRNA輪廓及特點

牦牛是青藏高原地區及周邊群眾賴以生存的重要生產生活資料之一。但其性成熟較晚，且普遍繁殖性能低下，成為長期制約牦牛產業發展的重要問題。sRNA介導的轉錄后基因調控是動植物的一種新型基因調控機制，它在個體發育調控、細胞分化、胚胎發育等生物過程中起著舉足輕重的作用。本研究將5頭牦牛的卵巢樣本RNA等量混勻，組成了一個牦牛卵巢樣本池，通過高通量測序技術后一共獲得12 126 208條純凈序列，其中有212 757條特異序列，由此表明文庫構建成功且測序質量良好。這些sRNA長度主要集中在20～23 nt，與M.M.Hossain等[18]研究結果基本一致。與牦牛基因組比對后發現共有60.89%的總序列及38.06%的特異序列能匹配。經功能注釋后發現miRNA(75.55%)占總序列數的大部分，但卻只占特異序列數的2.37%，由此表明miRNA在牦牛卵巢組織中有較復雜的調控機制。此外未注釋的sRNA有21.12%的總序列及68.92%的特異序列，可能是由于牦牛基因組的不夠完善。當然，隨著牦牛基因組序列信息的不斷補充，可以進一步利用其基因組信息進行牦牛sRNA的相關研究，這樣獲得的結果將會更加豐富和完善。

3.2sRNA與卵巢的功能

卵巢的濾泡發生和早期胚胎發育需要大量基因表達的協調和信息交流。這些基因的表達需要時空上的精準性，任何的表達改變均會導致卵母細胞和早期胚胎的發育異常。然而sRNA介導的調控通路可能是卵巢基因表達精準性的保障。目前研究表明，在哺乳動物卵巢組織中sRNA廣泛存在。S.Ro等[19]在成熟的老鼠卵巢中鑒定出122條成熟的miRNA，認為這些sRNA在卵巢的發育以及卵母細胞的成熟過程中起關鍵作用。此外，T.Mishima等[20]也在成年老鼠的卵巢中獲得已知miRNA，且一條新的miRNA，推測這些sRNA與小鼠的繁殖機能存在密切聯系。M.M.Hossain等[18]在牛的卵巢中發現了74條miRNA，其中有24條是新發現的miRNA。S.K.Tripurani等[21]在新生牛胎兒的卵巢中發現58條miRNA，其中有16條是首次發現。隨著測序技術以及計算機處理技術的快速發展，sRNA在生殖領域的的研究也做得更廣泛更深入。H.W.Ahn等[22]利用Illumina Genome Analyzer在老鼠新生胎兒的卵巢中對miRNA進行研究，結果發現516條miRNA，其中有118條miRNA是首次發現的。此外，C.J.Creighton等[23]利用Illumina GenomeAnalyzer深度測序技術，從正常和疾病女性生殖器官得到的103個組織或者細胞系建立sRNA文庫，發現了404個已知的miRNA和132個新miRNA。由此推測，sRNA在卵巢中有著及其重要的作用。

卵泡的生長與排卵過程的順利進行與sRNA存在密切的聯系。F.Tang等[24]研究表明，miR 30、miR 16、let 7和miR l792家簇在卵子發生和早期胚胎發育過程中的表達模式是動態變化的。let 7家族的miRNA在多種細胞活動包括細胞周期調控都有重要功能，隨著卵泡的生長其表達量逐漸增加。張曉東等發現let 7家族的多個成員在山羊卵巢中均有較高表達[25]。本研究中，let 7a、let 7b、let 7c、let 7f、let 7g和let 7e在牦牛卵巢中均有較高表達，其中let 7a表達量在所有sRNA中最高(187 666)。經靶基因預測和KEGG通路分析表明，let 7家族可能與Wnt、TGF-β等信號通路有關，從而影響卵泡發育、排卵和激素釋放等生殖活動[26]。目前已經證實sRNA與原始卵泡在卵巢內生長發育到成熟排卵也存在一定的聯系。D.Tesfaye等[27]發現在牛卵母細胞成熟過程中，有31個sRNA表達下調，28個表達上調；其中miR-125、miR-127等的上調表達對卵泡發育具有重要作用。近年來，研究報道sRNA與卵巢病變有關，且miRNA已成為卵巢病理診斷的重要手段。M.V.Iorio等[28]通過比較分析卵巢的腫瘤組織和正常組織發現，miRNA在卵巢上皮組織中表達差異顯著，其中，卵巢癌組織中過表達的miRNA有miR-200a、miR-141、miR-200c等，而miR-199、miR-140等明顯下調。此外，在轉錄前這些下調的miRNA的基因組拷貝數明顯低于正常值。經預測發現，這些miRNA家簇的靶基因主要調節細胞周期和免疫反應。這就意味著這些miRNA家簇的下調導致卵巢腫瘤的生長加速[29]。卵巢上皮細胞的異常增殖可能是卵巢癌發病的早期征兆。卵巢癌組織中miRNA-210和miRNA-214顯著下調，可能引起HIF和Akt信號通路的激活而促進腫瘤的生長[30]。功能早衰的卵巢組織中，miR-202、miR-146a、miR-125b-2、miR-139-3p、miR-654-5p等都過表達，而let-7c和miR-144表達卻低于正常組織[28]。本研究中，所采集的卵巢組織均來自成年的空懷期健康牦牛，未發現卵巢異常。然而有關sRNA在卵巢發育、卵泡生長、早期胚胎發育及卵巢病變中的功能研究還十分有限，有待進一步深入研究。

3.3牦牛sRNA的驗證及新miRNA的發現

牦牛卵巢中的sRNA與牛、人等的已知miRNA具有高度同源性，相似度在90%以上，表明牦牛的miRNA調控方式可能與其他動物有一定的相似性。其中有些miRNA家族表達量特別高，如let-7，miR140，miR199及miR320等，它們可能在牦牛卵巢中起重要調控作用。為了進一步驗證這些miRNA在牦牛卵巢中的表達，用RT-qPCR的方法對測序豐度較高的6個miRNA進行驗證，與測序結果基本一致，說明這些miRNA確實存在于牦牛卵巢中且表達量較高。測序結果發現miR-135a和miR-2316變化極顯著。H.W.Ahn等[22]報道miR-135a在新生小鼠卵巢中也大量表達，推測其在性腺的分化及發育過程中起重要作用。M.M.Hossain等[18]也在成年牛的卵巢中獲得miR-2316，推測miR-2316與牛的繁殖機能存在密切聯系，促使卵子細胞的分裂、胚胎的發育以及調節相關基因的轉錄。

盡管牦牛基因組序列不夠完善，本研究利用數據庫中的EST信息預測出5個新miRNA。當然這5個新預測的miRNA有待進一步驗證。大部分動物的miRNA靶位點分布在編碼區的某個互補位置，偶爾在5′端的非編碼區[31]。本研究所預測的新miRNA的注釋功能是參與細胞代謝以及一些生理加工過程，這一結果與之前的研究結果一致[32]，但與植物方面相關報道存在較大差異[33]。由于牦牛的全基因組以及其EST序列信息有限，確定新miRNA的潛在靶位點以及其功能存在較大的困難。

4結論

本研究應用高通量測序技術對牦牛卵巢進行了sRNA測序分析，研究其sRNA的表達譜。表達差異分析發現，在牦牛sRNA中有56個miRNA表達量比黃牛顯著上調，有33個miRNA表達顯著下調。與牦牛EST序列信息共預測出5個新miRNA。這些miRNA在牦牛中到底起到何作用，是否在決定牦牛高原適應性及繁殖性能中起調控作用，還需要進一步的驗證。

參考文獻(References)：

[1]XIONG X R，LAN D L，LI J，et al.Zebularine and scriptaid significantly improve epigenetic reprogramming of yak fibroblasts and cloning efficiency[J].CellReprogram，2013，15(4)：293-300.

[2]QIU Q，ZHANG G J，MA T，et al.The yak genome and adaptation to life at high altitude[J].NatGenet，2012，44(8)：946-949.

[3]LEE R C，FEINBAUM R L，AMBROS V.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J].Cell，1993，75(5)：843-854.

[4]BARTEL D P.MicroRNAs genomics，biogenesis，mechanism，and function[J].Cell，2004，116(2)：281-297.

[5]CHEN X M.A microRNA as a translational repressor of APETALA2 in Arabidopsis flower development[J].Science，2004，303(5666)：2022-2025.

[6]PERNAUTE B，SPRUCE T，RODRIGUEZ T A，et al.miRNA-mediated regulation of cell signaling and homeostasis in the early mouse embryo[J].CellCycle，2011，10(4)：584-591.

[7]LU C，TEJ S S，LUO S J，et al.Elucidation of the small RNA component of the transcriptome[J].Science，2005，309 (5740)：1567-1569.

[8]SUNKER R，ZHOU X F，ZHENG Y，et al.Identification of novel and candidate miRNAs in rice by high throughput sequencing[J].BMCPlantBiol，2008，8：25.

[9]YAO Y，GUO G，NI Z，et al.Cloning and characterization of microRNAs from wheat (Triticum aestivum L.)[J].GenomeBiol，2007，8(6)：R96.

[10]BEREZIKOV E，TETERING G V，VERHEUL M，et al.Many novel mammalian microRNA candidates identified by extensive cloning and RAKE analysis[J].GenomeRes，2006，16(10)：1289-1298.

[11]MORIN R D，O’CONNOR M D，GRIFFITH M，et al.Application of massively parallel sequencing to microRNA profiling and discovery in human embryonic stem cells[J].GenomeRes，2008，18(4)：610-621.

[12]HUANG A Y，WANG G C，HE L W，et al.Characterization of small RNAs fromUlvaproliferaby high-throughput sequencing and bioinformatics analysis[J].ChineseSciBul，2011，56(27)：2916-2921.

[13]BAEHRECKE E H.miRNAs：micro managers of programmed cell death[J].CurrBiol，2003，13(12)：R473-475.

[14]HOUBAVIY H B，MURRAY M F，SHARP P A.Embryonic stem cell-specific microRNAs[J].DevCell，2003，5(2)：351-358.

[15]SUBRAMANIAN S，FU Y，SUNKAR R，et al.Novel and nodulation-regulated microRNAs in soybean roots[J].BMCGenomics，2008，9：160.

[16]ALLEN E，XIE Z X，GUSTAFSON A M，et al.microRNA-directed phasing duing trans-acting siRNA biogenesis in plants[J].Cell，2005，121(2)：207-221.

[17]SCHWAB R，PALATNIK J F，RIESTER M，et al.Specific effects of microRNAs on the plant transcriptome[J].DevCell，2005，8(4)：517-527.

[18]HOSSAIN M M，GHANEM N，HOELKER M，et al.Identification and characterization of miRNAs expressed in the bovine ovary[J].BMCGenomics，2009，10：443.

[19]RO S，SONG R，PARK C，et al.Cloning and expression profiling of small RNAs expressed in the mouse ovary[J].RNA，2007，13(12)：2366-2380.

[20]MISHIMA T，TAKIZAWA T，LUO S S，et al.MicroRNA (miRNA) cloning analysis reveals sex differences in miRNA expression profiles between adult mouse testis and ovary[J].Reproduction，2008，136(6)：811-822.

[21]TRIPURANI S K，XIAO C D，SALEM M，et al.Cloning and analysis of fetal ovary microRNAs in cattle[J].AnimReprodSci，2010，120(1-4)：16-22.

[22]AHN H W，MORIN R D，ZHAO H，et al.MicroRNA transcriptome in the newborn mouse ovaries determined by massive parallel sequencing[J].MolHumReprod，2010，16(7)：463-471.

[23]CREIGHTON C J，BENHAM A L，ZHU H F，et al.Discovery of novel microRNAs in female reproductive tract using next generation sequencing[J].PLoSOne，2010，5(3)：e9637.

[24]TANG F，KANEDA M，O’CARROLL D，et al．Maternal microRNAs are essential for mouse zygotic development[J].GenesDev，2007，21(6)：644-648.

[25]ZHANG X D，LING Y H，ZHANG Y H，et al.MicroRNAs in ovaries of goats (Caprahircus) identified by solexa sequencing[J].ScientiaAgriculturaSinica，2013，46(1)：146-153.

[26]SIROTKIN A V，OVCHARENKO D，GROSSMANN R，et al.Identification of microRNAs controlling human ovarian cell steroidogenesis via a genome-scale screen[J].JCellPhysiol，2009，219(2)：415-420.

[27]TESFAYE D，WORKU D，RINGS F，et al.Identification and expression profiling of microRNAs during bovine oocyte maturation using heterologous approach[J].MolReprodDev，2009，76(7)：665-677.

[28]IORIO M V，VISONE R，DI LEVA G，et al.MicroRNA signatures in human ovarian cancer[J].CancerRes，2007，67(18)：8699-8707.

[29]ZHANG L，VOLINIA S，BONOME T，et al.Genomic and epigenetic alterations deregulate microRNA expression in human epithelial ovarian cancer[J].ProcNatlAcadSciUSA，2008，105(19)：7004-7009.

[30]GIANNAKAKIS A，SANDALTZOPOULOS R，GRESHOCK J，et al.miR-210 links hypoxia with cell cycle regulation and is deleted in human epithelial ovarian cancer[J].CancerBiolTher，2008，7(2)：255-264.

[31]GORAVANAHALLY M P，SALEM M，YAO J，et al.Differential gene expression in the bovine corpus luteum during transition from early phase to midphase and its potential role in acquisition of luteolytic sensitivity to prostaglandin F2 alpha[J].BiolReprod，2009，80(5)：980-988.

[32]OBERNOSTERER G，MARTINEZ J，ALENIUS M.Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections[J].NatProtoc，2007，2(6)：1508-1514.

[33]LIANG C W，ZHANG X W，ZOU J，et al.Identification of miRNA from Porphyra yezoensis by high-throughput sequencing and bioinformatics analysis[J].PLoSOne，2010，5(5)：e10698.

(編輯程金華)

Solexa Sequencing of Small RNAs in Yak (Bosgrunniens) Ovaries and Bioinformatics Analysis

XIONG Xian-rong1，LAN Dao-liang1，2，LI Jian1，2*，ZI Xiang-dong1，LIN Ya-qiu1，MA Li1

(1.CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041，China；2.InstituteofQinghai-TibetanPlateauResearch，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041，China)

Key words:yak；ovary；Solexa sequencing；small RNA；bioinformatics

Abstract:The small RNA transcriptome profile of yak ovary was described by Solexa deep sequencing，and provided the basic data for future study on yak breeding performance.In this study，yak ovaries were used for building small RNAs library，and then Solexa sequencing and bioinformatics were applied to analysis.Meanwhile，the expression of selected miRNAs was validated by RT-qPCR.After Solexa sequencing，a total of 12 126 208 clean reads were obtained from the ovary library，which contained 212 757 distinct sequences.Alignment analysis showed that 7 383 536 (60.89%) of total sequences and 80 981 (38.06%) distinct sequences were mapped to the yak reference genome.The results of differential expression analysis showed that 56 small RNAs were up-regulated and 33 small RNAs were down-regulated in yak ovary compared to the cattle counterparts.Among these RNA，miR-135a and miR-2316 had the largest fold-change.The expression of 6 selected miRNAs in yak ovary tissues obtained by RT-qPCR was consistent with the Solexa sequencing results.Furthermore，5 novel small RNAs were predicted after compared to the yak EST sequence information.All above suggested the small RNAs transcriptome profile of yak ovary was successfully described，and our results confirmed that Solexa sequencing technology has a great advantage in facilitating small RNA information and mining new miRNAs，and provide valuable small RNA data for further facilitate the yak genetic breeding and study the adaptation and resistance to high altitude and other related fields of highland animal.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.008

收稿日期：2015-04-21

基金項目：四川省科技支撐計劃(2014NZ0114);西南民族大學牦牛創新團隊(13CXTD01)

作者簡介：熊顯榮(1984-)，男，江西贛州人，碩士，主要從事牦牛細胞生物學和發育生物學研究，E-mail: xianrongxiong@163.com *通信作者：李鍵，教授，主要從事牦牛細胞生物學和發育生物學研究，E-mail: jianli_1967@163.com

中圖分類號：S823.8+5.2

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)01-0055-09