基于表達譜芯片挖掘清遠麻雞和科寶肉雞比目魚肌差異表達基因

束婧婷，章　明，宋　遲，單艷菊，徐文娟，宋衛濤，李慧芳

(江蘇省家禽科學研究所，揚州 225125)

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基于表達譜芯片挖掘清遠麻雞和科寶肉雞比目魚肌差異表達基因

束婧婷#，章明#，宋遲，單艷菊，徐文娟，宋衛濤，李慧芳*

(江蘇省家禽科學研究所，揚州 225125)

摘要：對生長速度長期的高壓選擇導致了快大型肉雞與優質型地方雞顯著的表型差異，本研究旨在研究這種表型差異的分子遺傳機理。采用Agilent雞全基因組表達譜芯片對達到性成熟的優質型清遠麻雞(112 d)和快大型科寶肉雞(42 d)比目魚肌中與肌纖維發育和類型組成相關的候選基因及信號通路進行系統篩查。結果，芯片分析共篩選到差異倍數在2倍及以上的基因1 318個，以科寶肉雞作為參照，清遠麻雞中上調基因501個，下調基因817個，主要涉及到肌肉發育、能量代謝、脂質代謝等生物學過程?；贙EGG Pathway分析發現，差異基因除了參與肌纖維發育和分化相關信號通路(如Hedgehog信號通路和Ca2+信號通路)外，Wnt信號通路，mTOR信號通路，MAPK信號通路，ErbB信號通路、JAK-STAT信號通路等一些跟能量代謝相關的信號通路也被富集為顯著的信號通路。與能量代謝相關的信號通路和與肌肉發育相關的信號通路相互作用形成一個調控網絡從而影響肌纖維的發育，篩選出了20個在肌纖維生長發育及分化過程中可能具有重要影響的候選基因，但這些差異表達基因在肌纖維的發育和分化過程中的作用尚待深入研究。

關鍵詞：肌纖維性狀；表達譜芯片；差異表達基因；清遠麻雞；科寶肉雞

隨著人們生活水平的不斷提高和消費觀念的轉變，肉品質愈來愈受到人們的重視。我國是一個禽類品種資源十分豐富的國家，各地方雞種多以肉質鮮美而著稱，尤其是廣東的清遠麻雞，素以皮色金黃、肉質嫩滑、皮脆爽、骨軟、風味獨特而馳名于粵港澳市場。本課題組前期研究發現，相較于快大型雞而言，清遠麻雞肌肉具有較高的紅肌纖維比例和肌纖維密度以及較細的肌纖維直徑[1]；而科寶肉雞是全球著名的快大型肉雞品種之一，具有生長速度快、飼料轉化率高、屠宰率高等優點，但肉質風味則較差。因此，這兩個品種是研究雞肌肉生長發育及肉品質遺傳機理的理想動物模型。

肌肉是雞胴體中最主要的組成部分，而肌纖維則是構成肌肉組織的基本單位，根據外觀、收縮特性和代謝特征可將肌纖維分成慢肌纖維(Ⅰ型和Ⅱa型，色紅，進行有氧代謝)和快肌纖維(Ⅱb型，色白，進行酵解代謝)[2]。不同部位的肌肉，其肌纖維組成和比例往往不同。如雞的比目魚肌主要由慢肌纖維組成，而趾長伸肌則主要由快肌纖維組成。研究表明，肌纖維類型是直接影響肌肉生長發育和肉品質的重要因素[3-4]。慢肌纖維多的肌肉品質相對較好，色紅、纖維細、風味好，而快肌纖維多的肌肉肉色蒼白、肉質較粗糙[5-6]。肌纖維的生長發育及類型的形成是受多基因影響和調控的復雜過程，在雞中，對于影響和調控這一復雜過程的分子機制還缺乏系統的研究。

基因芯片技術能夠同時檢測出某個特定組織中的大量差異表達基因，目前已被廣泛應用于生命科學研究等領域[7-8]。T.Wu等利用芯片技術研究發現，金華豬背最長肌中脂肪酸合成和抑制肌肉生成相關基因的上調表達可能是解釋該品種肌肉中IMF含量較高的原因[8]。Y.Li等研究發現，梅山豬背最長肌中的差異表達基因主要集中在TGF-α，MAPK，Wnt，mTOR和insulin等信號通路[9]。然而，目前在全基因組水平上比較不同品種雞肌肉中基因表達譜差異的報道較少，僅Q.Zheng等采用Affymetrix芯片對蛋雞和肉雞不同發育時期胸肌進行差異表達基因的篩選，發現了調控肌肉生長速度的一些關鍵基因[10]。本試驗采用Agilent雞全基因組表達譜芯片(4×44K，Design ID：026441)對肉質優良的地方雞種-清遠麻雞(Qingyuan partridge chickens，QP)和快大型的科寶肉雞(Cobb，CB)比目魚肌中的差異表達基因和信號通路進行研究，探討兩品種間肌肉組織表達譜的差異及其可能的分子生物學內在聯系與規律，以期為進一步研究調控肌纖維生長發育及肌纖維類型的分子機制提供理論依據，為優質雞肉質性狀的標記輔助選擇和育種奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗動物

清遠麻雞和科寶肉雞種蛋分別來自于廣東天農食品有限公司清遠麻雞原種場和廣東佛山新廣農牧有限公司科寶肉雞保種群。種蛋孵化后，在同樣的環境和飼養條件下進行飼養，全程自由采食和飲水。飼養至每品種性成熟日齡(清遠麻雞，112 d，平均體重1 330 g；科寶肉雞，42 d，平均體重2 825 g)時分別選取體重相近的10只母雞進行采樣，每只雞采集兩側比目魚肌，其中右側比目魚肌中間1 cm×1 cm部分用于肌纖維性狀的測定，左側相同部位樣品用于RNA抽提，所有樣品均置于液氮速凍，然后轉入-80 ℃冰箱保存備用，隨機選擇3個個體用于芯片分析。

1.2肌纖維性狀測定

在恒溫冷凍切片機內進行冰凍切片的制作，每個樣品在腓腸肌外側頭中間處垂直于肌纖維延展方向做10張連續橫切切片，切片厚度12 μm。采用ATPase堿孵育法進行肌纖維類型、肌纖維密度、肌纖維直徑和面積的判定，在經典的Guth-Samaha法[11]基礎上改良后進行染色，全部試劑均新鮮配制。

1.3RNA提取、質量檢測及純化

采用mirVanaTMRNA提取試劑盒 (Applied Biosystem p/n AM1556)提取總RNA，用Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent)對總RNA進行質量檢測，合格后使用QIAGEN RNeasy?Mini Kit(QIAGEN)和RNsae-Free DNase Set (QIAGEN)純化總RNA。

1.4基因芯片雜交

基因表達譜芯片采用Agilent公司的雞全基因組4×44K芯片(Design ID：026441)，探針數量為43 803。芯片雜交及數據處理由上海歐易生物醫學科技有限公司完成。采用Low Input Quick Amp Labeling Kit，One-Color試劑盒(Agilent)對總RNA進行放大和標記；總RNA經第一鏈和第二鏈合成得到cRNA，Cyanine-3-CTP(Cy3)標記cRNA鏈后，用QIAGEN RNeasy Mini kit(QIAGEN)純化標記后的cRNA；芯片雜交采用Agilent表達譜芯片配套試劑盒；采用Agilent Microarray Scanner進行掃描，分辨率為5 μm，掃描儀自動以100%和10% PMT各掃描1次，以Agilent自動合并2次結果作為最終結果；用Feature Extraction Software (version10.7.1.1，Agilent Technologies)讀取數據；用Genespring Software (version 12.5；Agilent Technologies)進行歸一化處理，算法為Quantile。所有操作均按試劑盒說明和Agilent表達譜芯片試驗操作和分析手冊進行。

1.5芯片數據生物信息分析

1.5.1差異表達基因的篩選利用Genespring Software 12.5對清遠麻雞和科寶肉雞比目魚肌標準化的數據進行篩選，保留所有標志都為P(Present探針點有信號，且信號值可信)的探針，去除含有M(Marginal探針信號飽和或信號值可疑)和A(Absent探針點無信號)的探針；去除內部質控探針。差異基因的篩選標準為：以科寶肉雞為對照，差異倍數在2倍及以上且P<0.05的基因。

1.5.2差異基因Gene Ontology功能注釋基于Gene Ontology數據庫(http：// www.geneontology.org/)，采用Molecule Annotation System (MAS 3.0，http：//bioinfo.capitalbio.com/mas3/)對差異表達基因進行GO分類分析，得到基因參與的所有GO，利用Fisher精確檢驗和卡方檢驗計算每個GO的顯著性水平，從而篩選出差異基因所體現的顯著性GO，顯著性篩選的標準為P<0.05。

1.5.3差異基因Pathway分析基于KEGG數據庫(http：//www.genome.jp/kegg/)，利用Fisher精確檢驗和卡方檢驗對差異基因參與的Pathway進行顯著性分析，按照P<0.05進行篩選，得到顯著的Pathway。

1.6熒光定量PCR

為驗證芯片的結果，本研究選擇了11個差異表達基因，根據GenBank中的基因序列設計引物(引物序列見表1)。以清遠麻雞和科寶肉雞比目魚肌總RNA為模板，采用SYBR Green I法進行熒光實時定量PCR反應，以β-actin基因作為內參基因進行數據的標準化處理，反應體系：2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL (10 μmol·L-1)，cDNA 模板1 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，加ddH2O 7.8 μL補足20 μL。反應條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 60 s，共40 個循環，擴增后經熔解曲線檢測特異性。每次反應均設空白樣品為陰性對照，每個樣品設置3個重復。相對定量的結果采用2-△△Ct法進行計算。采用Pearson’s相關檢驗對基因芯片和qRT-PCR 兩種方法的結果進行相關性分析。

2結果

2.1清遠麻雞和科寶肉雞比目魚肌肌纖維性狀比較

采用ATPase染色方法對兩個品種雞比目魚肌的肌纖維橫截面積、直徑、密度、紅肌纖維比例和白肌纖維比例等指標進行統計，結果如表2和圖1所示。兩品種雞比目魚肌在肌纖維橫截面積、直徑和密度上均表現出顯著差異，科寶肉雞的肌纖維橫截面積和直徑顯著高于清遠麻雞(P<0.05)，而肌纖維密度則顯著低于清遠麻雞(P<0.05)。清遠麻雞的紅肌纖維比例同樣要高于科寶肉雞，但差異不顯著(P>0.05)。研究結果進一步驗證了兩個品種在肉品質上存在差異。

表1熒光定量PCR引物

Table 1Primer sequences used for Q-PCR

表2兩個品種雞比目魚肌肌纖維性狀比較

Table 2Myofiber characteristics of the SOL muscles in the 2 chicken breeds

NS.P>0.05；*.P<0.05

2.2兩個品種比目魚肌中的差異表達基因

采用Agilent雞全基因組表達譜芯片比較優質型的清遠麻雞和快大型的科寶肉雞比目魚肌基因表達譜差異，共發現差異倍數在2倍及以上的基因1 318個(P<0.05，FC≥2)，以科寶肉雞作為參照，清遠麻雞中上調基因501個，下調基因817個。

較細的纖維直徑和較高的紅肌纖維比例可能是導致清遠麻雞肉質優良的關鍵因素，因此為了闡明基因表達模式差異與不同表型之間的關系，基于NCBI的OMIM數據庫以及已發表的文獻報道，找到了一些與肌纖維發育及類型組成相關的重要基因，詳見表3。與科寶肉雞相比，清遠麻雞比目魚肌中PPARGC1B、PPARD、PRKAG1、HSPB1、MAPK6、GDF3、STAT5B以及PRKAG3基因的表達是上調的，而MYH1E、MYH1B、WNT11、IGF1、MYOG、MYO1A、PRKAR2B、FGF7、WNT2B、SCD5、FASN及WNT5A等基因的表達是下調的。

2.3差異表達基因的GO功能分類分析

采用MAS3.0軟件對差異表達基因進行GO(GO ontology)功能分類，如圖2所示。在生物學過程方面，共發現167個顯著性GO，主要涉及到細胞過程、生理過程、生物學調控、生物學過程的調節、多細胞生物過程、發育學過程、應激反應、免疫系統加工過程、生物學過程的正調控和負調控等。

2.4差異表達基因的信號通路分析

對差異表達基因通過KEGG數據庫進行信號通路分析，富集檢測的P<0.05的與肌纖維發育及類型組成相關的信號通路總共有18條，包括MAPK信號通路，涉及的基因有EGFR、HSPB1和FGF7；鈣離子信號通路(Calcium signaling pathway)，涉及的基因有PDGFRA、PDGFRB、PLCB1、NOS1和SLC8A3；Wnt信號通路，涉及的基因有SFRP2、WNT9A、WNT2B、FZD2、WNT8B、PPARD、LEF1、WNT11、WNT5A和VANGL2；Hedgehog信號通路，涉及的基因有BMP4、BMP5和PTCH1；TGF-beta信號通路，涉及的基因有BMP4、BMP5、SMAD1、FST和THBS4；ErbB信號通路，涉及的基因有PIK3R1、PIK3R3和STAT5B；Jak-STAT信號通路，涉及的基因有PIK3R1、PIK3R3和SPRED1；mTOR信號通路，涉及的基因有IGF1、PIK3R1、PIK3R3和PRKAA2；不飽和脂肪酸合成信號通路，涉及的基因有SCD5、FADS1和TECR；脂肪酸合成通路，涉及的基因為FASN；以及Notch信號通路，涉及基因為NOTCH2等。每個信號通路均只包含幾個發生表達變化的基因，而每個表達變化的基因通常不局限于一個通路。

2.5差異表達基因的熒光定量PCR驗證

為了驗證基因芯片所篩選的差異表達基因，隨機選取了11個基因，其中上調基因3個(PRKAG3、STAT5B和BMP4)，下調基因8個(MYH1E、EGFR、ADIPOQ、PIK3R3、FASN、NOTCH2、SCD5和WNT5A)，以β-actin為參照基因，采用熒光定量PCR的方法進行了驗證。盡管芯片和熒光定量PCR兩種方法所得到的差異倍數有所不同，但所選基因的表達趨勢是一致的，通過相關分析發現，兩種方法所得的結果具有正相關關系，Pearson相關系數為0.33～0.93(圖3)，結果進一步驗證了芯片結果的可靠性。

表3清遠麻雞與科寶肉雞中篩選到的一些與肌纖維發育及類型組成相關的基因

Table 3List of representative genes related to myofiber characteristics in soleus muscle in Qingyuan Partridge chickens and Cobb broilers

3討論

骨骼肌是由異源特異性的肌纖維組成，不同類型的肌纖維在形態、數目、收縮和代謝特性等方面差異較大，因而由不同類型的肌纖維組成的肌肉之間也存在較大差異，而肌纖維的類型組成與肌肉品質(肉色、嫩度、風味、多汁性)密切相關。本研究發現，清遠麻雞比目魚肌的肌纖維密度顯著高于科寶肉雞，而肌纖維橫截面積和直徑卻顯著低于科寶肉雞，這一結果進一步驗證了E.Dransfield等的結果[12]，即禽類在出生后生長發育過程中，肌纖維數目多則生長緩慢，反之，肌纖維數目少則生長快速，同時也與肌纖維大小與肉品質呈負相關的觀點相符[13]。清遠麻雞比目魚肌中的紅肌纖維比例要高于科寶肉雞同樣證實了G.Renand等[14]的觀點，即紅肌纖維比例高的肌肉品質較好。為了進一步揭示優質型的清遠麻雞和快大型的科寶肉雞在肌纖維性狀上差異的機理，本研究采用Agilent雞全基因組表達譜芯片首次探討了兩個品種雞比目魚肌在轉錄組水平上的差異，以期尋找與肌纖維發育及類型組成相關的基因。盡管熒光定量PCR與芯片兩種方法得出的基因差異倍數并不完全相同，但兩種方法下的基因表達趨勢是高度一致的，表明本研究芯片分析得出的結果是可信的。

成年動物肌纖維組成及其收縮蛋白結構和功能的多樣性在很大程度上由神經活動支配，因此，與肌肉發育、脂肪代謝、能量代謝和神經活動相關的基因均可能會影響肌纖維的發育和分化。本研究GO功能分類結果表明，參與到細胞過程、生理過程、生物學調控以及能量代謝等過程的基因在兩品種中的表達具有顯著差異，說明不同肌纖維類型具有不同的能量代謝調控特征，與A.Vidal-Puig等[15]報道結果一致。能量利用率對成熟肌纖維的形成以及肌纖維的增殖分化是至關重要的，M.Louis等[16]發現，培養的肌衛星細胞中能值水平直接影響肌纖維的肥大，M.Cagnazzo等[17]也發現成肌細胞分化和能量代謝密切相關。

肌纖維發育和類型組成受到多條信號通路和諸多因子的調節，本研究共發現18條與之相關的代謝通路，其中包括一些已知的在肌纖維發育與分化中具有重要作用的信號通路，如Hedgehog信號通路和Ca2+信號通路[18]。根據基因功能及其所在的信號通路，我們確定了20個影響肌纖維生長發育及分化的候選基因，其中包括7個已知的與肌纖維發育與類型組成相關的基因(PPARGC1B、PPARD、MYH1E、MYH1B、MYOG和MYO1A)。PPARD(Peroxisome proliferator-activated receptor delta)在多種組織如脂肪組織、骨骼肌和心中對脂質、脂蛋白和葡萄糖代謝調控起著關鍵作用[19]；PPARGC1B(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma，coactivator 1 beta)是一種轉錄協同激活因子，也是細胞能量代謝和能量平衡的關鍵調節因子，可促進骨骼肌中線粒體的產生，并誘導氧化型肌纖維的形成[20]；上述兩個基因在本研究清遠麻雞的比目魚肌中均高表達，也進一步驗證了Z.Arany等[20]的研究結果，即在促進氧化型肌纖維形成中發揮作用。MyoG基因主要在肌纖維分化末期表達，在肌細胞的早期分化過程中處于中心位置，本研究發現，該基因在科寶肉雞中的表達量要高于清遠麻雞，可能也與品種特性有關。MYH1E、MYH1B和MYO1A與肌球蛋白的生物合成有關，不同類型的肌纖維特異性地表達各自特殊類型的肌球蛋白重鏈(MYH)，而MYH1即為快肌纖維特異性表達基因，故本研究MYH1E和MYH1B基因均在白肌纖維比例較高的科寶肉雞中高表達。

本研究中，Wnt信號通路、mTOR信號通路、MAPK信號通路、ErbB信號通路、JAK-STAT信號通路以及一些跟能量代謝相關的信號通路也被富集為顯著的信號通路，表明與能量代謝相關的信號通路和與肌肉發育相關的信號通路互作形成一個調控網絡從而影響肌纖維的發育。在20個關鍵基因中有3個(PRKAG1、PRKAG3和PRKAR2B)是與能量代謝密切相關的。PRKAG1和PRKAG3分別是編碼一磷酸腺苷激活蛋白激酶(A heterotrimeric serine/threonine protein kinase，AMPK) γ1和γ3亞基的基因，PRKAG1在各種組織中廣泛表達，而PRKAG3則只在骨骼肌中特異性地表達。本研究中，PRKAG1和PRKAG3均在清遠麻雞比目魚肌中高表達，可能是因為激活的AMPK復合物通過磷酸化作用抑制了糖原合成酶活性，降低了糖原的合成速率從而導致肌肉中糖原含量的下降。但PRKAG3在比目魚肌中的高表達與M.Mahlapuu等[21]在人、大鼠和小鼠中的研究結果相悖，他們發現，PRKAG3主要在快速酵解型的白肌中表達，而在慢速氧化型的紅肌中表達量較低。PRKAR2B是編碼AMPKβ2亞基的基因，其在清遠麻雞比目魚肌中的表達量要低于科寶肉雞，結果與AMPKβ亞基中存在一個糖原結合位點從而抑制了AMPK的激活[22]這一事實相符。因此，值得擴大群體規模進一步研究這些基因表達與肌纖維類型之間的關系。

硬脂酰輔酶A去飽和酶5(Stearoyl-CoA desaturase5，SCD5)和脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase，FASN)兩個基因是脂肪酸合成關鍵酶基因，在科寶肉雞比目魚肌中具有較高的表達水平。SCD是催化包括棕櫚酰CoA、硬脂酰CoA在內的飽和脂肪酸產生單不飽和脂肪酸合成的關鍵酶，對肌肉間脂肪沉積有著重要影響。本研究發現，一些能夠抑制成肌細胞分化的生長因子如FGF7和GDF3，以及能夠促進成肌細胞分化和肥大的誘導因子如IGF-I在兩品種雞的比目魚肌中同樣表現出較大的表達差異。Wnt信號通路是一條保守的信號通路，廣泛存在于各種動物細胞內。Wnt家族是一個非常龐大的多基因家族，主要參與細胞的增殖與分化過程。本研究發現Wnt家族的Wnt11，Wnt5a，Wnt9a，Wnt2b和Wnt8b均表現為差異表達基因，不同的Wnt配體因其活性的差異可以激活不同的信號通路從而調控骨骼肌細胞增殖、分化、凋亡和遷移。K.Anakwe等[18]研究發現，不同的Wnt基因都可以不同程度的改變肌纖維總量和快慢肌纖維的組成，Wnt11能促使快肌纖維增多，這也與本研究該基因在科寶肉雞中的表達水平較高的結果一致。因此，將這些基因作為影響不同肌纖維類型的代謝特征和收縮特性轉錄調控的新候選基因進行深入的研究具有一定的意義。

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(編輯郭云雁)

Identification of Differentially Expressed Genes for Myofiber Characteristics in Soleus Muscles between Qingyuan Partridge Chickens and Cobb Broilers

SHU Jing-ting#，ZHANG Ming#，SONG Chi，SHAN Yan-ju，XU Wen-juan，SONG Wei-tao，LI Hui-fang*

(JiangsuInstituteofPoultryScience，Yangzhou225125，China)

Key words:myofiber characteristics；microarray；differentially expressed gene；Qingyuan Partridge chicken；Cobb broiler

Abstract:In the modern chicken industry，fast-growing broilers have undergone strong artificial selection for muscle growth，which has led to remarkable phenotypic variations compared with slow-growing chickens.The present study was designed to explore the molecular mechanism underlying these phenotypes differences.Agilent cDNA microarray analyses were conducted to determine gene expression profiles of soleus muscle sampled at sexual maturity age of Qingyuan Partridge chickens (QY，112 d，a slow-growing Chinese breed with high meat quality) and Cobb broilers (CB，42 d，a commercial fast-growing broiler line).A systematic identification of candidate genes and new pathways related to myofiber development and composition in soleus muscles between the 2 breeds were analyzed.1 318 genes with at least 2-fold differences were identified in soleus muscles of QY and CB chickens.When slow-growing QY chickens were compared with fast-growing CB chickens，the expression of 501 genes were up-regulated，and 817 genes were down-regulated.These genes mainly were related to muscle development，energy metabolism or lipid metabolism processes.In addition，based on KEGG pathway analysis，it was found that in addition to pathways affecting myofiber development and differentiation (pathways for Hedgehog & Calcium signaling)，energy metabolism signaling pathways (Wnt signaling pathway，mTOR signaling pathway，MAPK signaling pathway，ErbB signaling pathway and JAK-STAT signaling pathway) were also enriched.Our data indicates that energy and muscle metabolism pathways might form a network，which influence the development of myofibers，20 genes were potentially related to myofiber development and composition.However，large scale analyses are still required to validate the role of the genes identified and ultimately to find molecular markers that can be used for selection or to optimize rearing practices.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.004

收稿日期：2015-01-22

基金項目：國家自然科學基金(31301967)；現代農業產業技術體系建設專項資金(CARS-42-G03)；江蘇省自然科學基金(BK2012268)；江蘇省農業科技自主創新資金項目(cx(15)1009)

作者簡介：束婧婷(1980-)，女，江蘇宿遷人，博士，副研究員，主要從事家禽遺傳育種研究，Tel：0514-85599018，E-mail：shujingting@163.com；章明(1978-)，男，江蘇姜堰人，碩士，副研究員，主要從事家禽遺傳育種研究，E-mail：6259513@qq.com。二人共為第一作者 *通信作者：李慧芳，研究員，E-mail：lhfxf_002@aliyun.com

中圖分類號：S813.2

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)01-0025-09