羊卵母細胞的體外成熟培養技術研究進展

佟桂芝，宋　斌，董正德

(黑龍江省畜牧研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

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羊卵母細胞的體外成熟培養技術研究進展

佟桂芝，宋斌，董正德

(黑龍江省畜牧研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

卵母細胞采集方法分為從屠體卵巢和活體采卵兩大類。屠體卵巢采卵主要有抽吸法和切割法。優點是成本低廉，可以變廢為寶。缺點是胚胎的譜系不清。活體采卵技術有兩種分別是腹腔鏡采卵和超聲波引導陰道穿刺采卵。其優點是對母羊損傷小、母羊利用率高、胚胎的譜系清楚。以及影響卵母細胞質量和產量的因素：激素、血清、卵泡液、生長因子等一些因素的作用。現介紹目前羊卵母細胞采集和影響體外成熟因素方面的研究進展。

羊；卵母細胞；采卵；體外成熟

羊卵母細胞體外成熟(IVM)是進行體外胚胎生產(IVP)、轉基因動物生產以及輔助生殖(ART)技術開展的基礎和關鍵。通過在成熟培養液中添加激素、生長因子等促進卵母細胞成熟已取得一定的進展[1]。目前影響羊卵母細胞體外成熟的因素有以下幾個方面。

1　卵母細胞的采集

1.1屠體卵巢采集卵母細胞

從屠體卵巢獲得卵母細胞主要有抽吸法或切割法。抽吸法是用18號或20號注射器針頭從卵巢卵泡抽吸獲得卵母細胞。切割法為切割卵巢組織分離卵母細胞。這兩種方法能夠得到大量不同時期的卵母細胞。這種方法的最大優點是材料來源豐富，成本低廉，但確定母畜的系譜困難[2]。

1.2活體取卵

1.2.1腹腔鏡采卵腹腔鏡采卵技術

腹腔鏡采卵腹腔鏡采卵技術[3]相對簡單且高效。這一技術快速、廉價并且能夠多次重復采卵，沒有并發癥。在對動物進行常規麻醉后進行，采卵大約耗時20min。腹腔鏡采卵技術可以用于經過激素處理的母羊。每只綿羊每周可采卵2次，卵母細胞的回收率為68%，平均每只母羊每個發情周期能夠采集到4.6枚卵母細胞。經超數排卵的山羊利用這一方法得到的卵母細胞回收率為75%～85%，平均每只山羊能夠得到13.5個卵母細胞。這一技術的主要缺點是用吸管從卵泡中吸出卵母細胞時會導致卵丘細胞丟失。

1.2.2超聲波引導陰道穿刺采卵

超聲波引導陰道穿刺采卵[4]是一種安全的卵母細胞采集方法。卵母細胞回收率類似于腹腔鏡采卵，但是能夠看到和抽取的卵泡數量比腹腔鏡采卵少。最好在對動物進行eCG和FSH單獨或結合處理之后進行采卵，這樣能夠增加可采卵泡數量。該技術在山羊已經有應用，但是想要成熟的掌握這一技術需要很多的實踐練習。

2　影響卵母細胞成熟的因素

2.1激素對卵母細胞的成熟起重要作用

在成熟液中添加促性腺激素(FSH和LH)和17β-雌二醇能夠提高卵母細胞的成熟率。促性腺激素是哺乳動物體外培養核成熟的主要調節器。成熟液中添加促性腺激素有助于羔羊的卵母細胞的成熟。雌二醇可能刺激DNA聚合酶β和提高假雄原核生長因子的合成,這兩種物質都參與細胞質的成熟。FSH起到誘發卵丘細胞擴散，暫時性抑制生發泡破裂，延遲第一次成熟分裂的時間，促進細胞質成熟。LH能增強卵母細胞的存活力，引起卵丘細胞變化，便于精子受精。綿羊卵母細胞的研究中，人們添加不同濃度的FSH和LH，O'Brien等添加FSH和LH的量均為10μg/mL[5]。

2.2卵巢的運輸時間和溫度

牛、羊卵巢從屠宰場獲得。運輸溫度及時間很重要。牛卵巢在37～39℃保存8h，卵母細胞成熟率下降，25℃保存8h，成熟率沒有明顯變化(Yang等，1990)[6]。Moodie等[7]研究證明，綿羊卵巢在22℃保存數小時，卵母細胞成熟率無明顯影響；體溫條件，卵母細胞成熟率明顯下降。孫桂金等(2006)[8]實驗，運輸溫度在28℃卵母細胞成熟率顯著高于22℃和35℃ 。37℃接近綿羊體溫，卵巢生理活動旺盛，卵巢在離體環境中得不到充足的營養物質，使卵母細胞中部分物質發生降解。卵巢的貯存溫度對卵母細胞體外成熟的影響機理還有待進一步研究。

2.3血清對卵母細胞體外成熟的影響

在成熟液中通常要加10%～20%熱滅活的血清，因為血清能夠為COCs提供營養并且能防止透明帶硬化[9]。大多數羊卵母細胞的體外成熟都用FBS。盡管在成熟液中的可以不添加發情山羊血清(EGS)，但是在不加促性腺激素時，添加10%FBS、10%EGS或者10%ESS的成熟液培養山羊卵母細胞能夠獲得很高的成熟率。成熟液中添加5%發情牛血清能提高綿羊卵母細胞成熟質量。(趙曉娥等，2005)[10]實驗證明，綿羊卵母細胞體外成熟時，添加血清顯著地提高成熟率。

2.4生長因子

表皮生長因子(EGF)，胰島素樣生長因子(IGF)等均影響卵母細胞體外成熟[11]。表皮生長因子(EGF)能影響多種哺乳動物卵母細胞成熟和囊胚發生，也可能影響到綿羊和山羊卵泡生長和卵母細胞成熟。在有表皮生長因子存在的情況下綿羊卵母細胞能夠獲得更多的卵丘細胞擴展和更高的受精率。EGF添加量在3ng/mL以下對山羊卵母細胞體外成熟沒有顯著影響。在成熟液中添加50ng/mL EGF能提高山羊胚胎生產率。在成熟液中添加神經生長因子恢復減數分裂的卵母細胞大于70%。而胰島素樣生長因子-1(IGF-1)不會對卵母細胞成熟產生影響[11]。在卵母細胞成熟培養液M199中加入EGF，發現濃度(1、10、100 pg/L)可促進卵丘擴張，顯著提高卵母細胞達到M II期比例。艾繼輝(2003)[12]等證明：EGF可促進裸卵的成熟率。魯進等(2005)[13]研究表明，顆粒細胞分泌的IGF-1單獨或與促性腺激素協同作用能促進卵母細胞成熟。宋凱等(2014)[14]本試驗僅在成熟培養階段的不同培養液(血清培養體系，FBS和牛血清白蛋白培養體系，BSA)中添加不同濃度VEGF(5ng/mL和10ng/mL)，結果添加血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)兩試驗組卵母細胞成熟率提高到84.61%和82.87%(P<0.01)；BSA體系中，2試驗組成熟率分別提高到82.40%和79.21% (P<0.01)，無論是FBS體系還是BSA體系，添加VEGF的各個試驗組成熟卵經受精后的胚胎發育都有不同程度的提高，且具有差異顯著性。VEGF可能與血清中的未知因子協同作用，有效地提高了羊卵母細胞體外成熟率。

2.5卵丘細胞的影響

黃承俊等(2014)[15]試驗表明：添加離散卵丘細胞能夠顯著促進機械裸卵(DOs)的體外成熟(57.98±14.27 VS 35.53±14.00，P<0.05)，對卵丘-卵母細胞復合體(COCs)具有促進趨勢但差異不顯著(76.66±5.77 VS 66.76±9.46，P>0.05)；卵母細胞胞外卵丘細胞對共培養的DOs的體外成熟促進作用效果不明顯(35.83±18.32 VS 35.53±14.00，P>0.05)。結果表明：添加的離散卵丘細胞主要以旁分泌途徑促進卵母細胞的體外成熟；3層及其以上胞外卵丘細胞能夠提高其包裹的卵母細胞平均體外成熟能力的85.34%，添加的離散卵丘細胞能夠提高COC平均體外成熟能力的16.18%，能夠提高DO平均體外成熟能力的60.61%。

2.6卵泡直徑、卵泡直徑和卵母細胞成熟率相關

卵泡直徑、卵泡直徑和卵母細胞成熟率相關,Crozet等[15]的實驗表明成年山羊的卵泡直徑和卵母細胞成熟力及早期胚胎體外發育力有直接的關系，卵母細胞來自直徑大于5mm的卵泡的經體外成熟、體外受精、胚胎體外培養發育到囊胚的能力明顯高于小卵泡。但性未成熟山羊卵巢中卵泡直徑大多數為2.5～3mm，所以從性未成熟山羊中很難采集到直徑大于5mm的卵泡。因此從性未成熟山羊獲得的卵母細胞在發育能力上比成年山羊低。卵母細胞直徑與其發育能力有直接關系，直徑大于135μm的山羊卵母細胞發育能力最強，直徑小于110μm的卵母細胞不能成熟發育。直徑大的卵母細胞發育能力強可能和MPF活性有關，直徑較大的山羊卵母細胞經過體外成熟培養后其MPF活性明顯高于直徑小的卵母細胞。史文升(2008)[16]試驗表明：卵泡直徑2mm≤D≤8mm的卵泡中的卵母細胞體外成熟率明顯高于8mm

2.7褪黑素的影響

活性氧(ROS)是決定卵母細胞成熟、胚胎發育及其形態改變的重要因素。王超(2011)[17]發現牛卵母細胞體外成熟時填加10～50ng/mL褪黑素能促進卵母細胞從MⅠ到MⅡ期的發育，提高核的成熟率，對于胞質線粒體的均勻分布卵丘擴展起促進作用。進行體外成熟過程中卵母細胞，氧氣濃度、褪黑素的功能；高氧濃度下，褪黑素能顯著促進牛卵母細胞成熟，這意味著褪黑素作用的發揮依賴于培養條件。李曉霞等(2015)[18]，添加10 M 褪黑素既可顯著提高牛卵母細胞的成熟率(62.5 VS 77.8 )(P<0．05)；受精后胚胎體外發育的卵裂率(53.2 VS 67.6 )(P<0.05)和囊胚率(20.3 VS 35.4)。裸卵暴露在ROS中會導致減數分裂靜止及卵母細胞退化。不同階段卵母細胞抵抗ROS的能力決定著發育能力。

最近幾年的科研在羊卵母細胞采集技術以及體外成熟技術上取得很大進展，使體外胚胎的移植妊娠率和產羔率有了較大的提高。弄清卵母細胞成熟的分子水平控制機制將有助于發現影響胎兒及胎盤發育的因素和造成胎兒異常及妊娠異常的原因是體外胚胎，最終提高體外生產羊、轉基因羊及克隆羊等的胚胎質量和效率。

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2015-12-16

2015-12-17

佟桂芝(1967-)，女，研究員，碩士，從事反芻動物的飼養與繁殖工作。

10.19369/j.cnki.2095-9737.2016.09.004

S826.3

A

2095-9737(2016)09-0007-02