頂空氣相色譜法測定黃芪提取物中大孔樹脂有機溶劑殘留

蔡振華 金松子 蔣慶峰

[摘 要] 目的：建立黃芪提取物中8種大孔樹脂有機溶劑殘留物和乙醇溶劑殘留物測定方法。方法：采用DM-624毛細管氣相色譜柱，二甲基甲酰胺-水溶液為溶解介質，氮氣為載氣，檢測器為氫火焰離子化檢測器（FID）。測定黃芪提取物中乙醇、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙基苯、二乙烯基苯、正十二烷9種有機溶劑殘留量。結果：9種有機溶劑完全分離，精密度RSD均小于7.4%，峰面積與濃度均呈良好的線性關系，9種溶劑的平均回收率為84.6%～106.5%，其RSD<6.0%。結論：本方法簡便、準確、重線性好，適用于使用大孔樹脂后黃芪提取物中苯系列殘留物檢測。

[關鍵詞] 黃芪提取物；頂空氣相色譜法；大孔樹脂；殘留溶劑

中圖分類號：O657 文獻標識碼：A 文章編號：2095-5200（2016）01-081-04

本品為黃芪提取物，屬于環黃芪醇（CycLoastra-genoL）類化合物，是豆科黃芪屬植物中指標性成分類群，是常用中藥黃芪中主要生物活性成分，具有調節免疫、強心、抗心腦缺血損傷、保肝、抗炎、抗病毒以及改善腎臟、胰島損傷等諸多藥理作用。

在提取制備工藝過程中使用了大孔吸附樹脂。近年來，大孔吸附樹脂已廣泛用于中藥活性成分（如皂苷、總黃酮、內酯、生物堿等大分子化合物）提取分離與純化，但大孔樹脂制造過程中，會帶來少量苯、二甲苯、苯乙烯等有害成分，從而造成被提取、純化出來提取物中含有害物質殘留風險[1-2]。

根據中國藥典[3]和ICH（人用藥品注冊技術規范國際協調會）藥品中有機溶劑殘留量測定指導原則，有必要對大孔樹脂有機殘留建立檢測方法，對其殘留量加以控制。目前有關大孔樹脂有機溶劑殘留測定方法[4-7]及醇類測定方法[8-9]多數采用頂空氣相色譜法，也有采用直接進樣氣相色譜法[10]。本實驗建立了頂空氣相色譜法測定黃芪提取物中大孔樹脂有機溶劑殘留物以及測定提取過程中使用到乙醇殘留物方法。

1 儀器與試劑

HP 6890N 氣相色譜儀，Agilent 7694E 頂空進樣器，氫火焰離子化檢測器（FID），DM -624 毛細管柱（30.0m×0.53mm×3.00?m） （6%-氰丙基苯-94%-二甲基硅氧烷共聚物），試劑：無水乙醇、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙基苯、二乙烯基苯、正十二烷、N，N-二甲基甲酰胺（均為分析純）、蒸餾水。黃芪提取物樣品（批號：20120902、20121215、20121216、20121217 ）由天津藥物研究院提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

柱溫采用程序升溫：以40℃維持2min，以6℃/min升溫速率升溫至200℃，維持2min。氣化室溫度為250℃，載氣（氮氣）流速為5.0 mL/min，分流比1∶1，氫火焰離子化檢測器（FID），檢測器溫度為250℃。

2.2 頂空條件

頂空平衡溫度為100℃，平衡時間30min，進樣體積3mL。

2.3 對照品貯備液及對照品溶液配制

取無水乙醇、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙基苯、二乙烯基苯、正十二烷，精密稱定，加二甲基甲酰胺制成濃度分別為2.5248?g/mL、0.0098?g/mL、

0. 0009?g/mL、0.0104?g/mL、0.0097?g/mL、0.0103?g/mL、

0.0103?g/mL、0.0101?g/mL、0.0097?g/mL溶液，作為混合對照品貯備液；精密量取此液5mL置裝有適量二甲基甲酰胺水溶液50mL量瓶中，用二甲基甲酰胺水溶液稀釋到刻度，混勻，即得對照品溶液。

稀釋劑：二甲基甲酰胺水溶液（DMF：H2O=5：2）。

2.4 專屬性

經試驗證實，溶劑二甲基甲酰胺水溶液不干擾待測溶劑乙醇、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙基苯、二乙烯基苯、正十二烷等色譜峰，樣品中其他雜質峰不干擾各待測溶劑峰，說明本法專屬性強。見圖1。

2.5 精密度測定

取6份對照品溶液2mL分別置10mL頂空瓶中，加蓋密封。依次連續進樣測定，計算峰面積RSD。結果：乙醇、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙基苯、二乙烯基苯、正十二烷積分面積（n=6）RSD，分別為1.55%、2.73%、1.00%、2.56%、7.36%、1.97%、2.52%、4.12%、4.17%。

2.6 標準曲線試驗

分別移取對照品貯備液0.5、0.8、1.0、1.2、1.5mL置10mL量瓶中，用二甲基甲酰胺水溶液稀釋到刻度，混勻，配成不同濃度對照品溶液，分別取不同濃度對照品溶液2mL置10mL頂空瓶中，加蓋密封，依次進樣測定。以各溶劑峰峰面積（Y）對質量濃度（X）進行線性回歸，結果見表1。

2.7 回收率試驗

分別精密量取對照品貯備液2.0、2.5、3.0mL到裝有適量二甲基甲酰胺水溶液25mL量瓶中，用二甲基甲酰胺水溶液稀釋到刻度，搖勻，配成不同濃度對照品溶液（80%、100、120%限度）。

精密稱取9份黃芪提取物樣品（20120902）1000mg置10mL頂空瓶中，分別加入上述不同濃度對照品溶液2.0mL，加蓋密封，搖勻，作為系列回收率測試溶液，每個濃度各3份。另取1000mg黃芪提取物樣品（20120902）置10mL頂空瓶中，加二甲基甲酰胺水溶液2.0mL，加蓋密封作為樣品空白溶液。結果見表2。

2.8 檢測限及定量限

取對照品溶液用二甲基甲酰胺水溶液逐步稀釋，精密吸取2mL置10mL頂空瓶中，進行測定，確定信噪比約為3時檢測量作為檢測限，信噪比約為l0時檢測量作為定量限。結果見表3。

2.9 樣品測定

取20120902、20121215、20121216、20121217四批樣品，精密稱取1000mg到頂空瓶中，加2mL二甲基甲酰胺水溶液溶解混勻，加蓋密封，以外標法進行測定。色譜圖見圖1。

四批樣品中苯、二甲苯、苯乙烯均未檢出，乙醇、正己烷、甲苯、二乙基苯、二乙烯基苯、正十二烷含量均符合中國藥典2010年版標準。結果見表4。

3 討論

3.1 溶劑選擇

大孔樹脂殘留物（正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、1，4一二乙基苯、二乙烯基苯、正十二烷）均難溶于水，在有機溶劑中溶解性好。黃芪提取物樣品不溶于水，在二甲基甲酰胺、二甲基亞砜中易溶。根據其性質分別考察了二甲基亞砜、二甲基乙酰胺及二甲基甲酰胺3種溶劑。

試驗中發現采用純有機溶劑會使這些殘留物在液-氣兩相中分配系數K增加，導致檢測靈敏度下降。故考慮采用有機溶劑和水混合溶劑。參考有關文獻[6-7]，先后摸索了以下幾種混合溶劑：二甲基甲酰胺-水溶液，二甲基乙酰胺-水溶液，二甲亞砜-水溶液等系統。但二甲亞砜-水溶液在溫度較低時容易凝固，二甲基乙酰胺-水溶液在二乙基苯位置空白有干擾，而二甲基甲酰胺-水溶液對測定無干擾。

接著又考察DMF-水混合溶劑不同比例。在保證黃芪提取物樣品全部溶解情況下，二甲基甲酰胺-水最大比例為5：2。故選擇二甲基甲酰胺-水（5：2）混合溶液作為溶媒，既保證待測殘留物與樣品都能溶解，又增大了殘留物在頂空氣體中濃度，使分析靈敏度提高。

3.2 頂空條件選擇

由于本法同時測定9種沸點相差較大殘留溶劑，研究中發現頂空溫度和頂空加熱平衡時間對各溶劑峰峰面積影響較大，因此考察了頂空平衡溫度分別為90℃、100℃、110℃及平衡時間分別為20min，30min，40 min時各成分出峰情況，結果表明頂空平衡時間在110℃時各峰響應最大，但樣品會產生分解峰干擾殘留溶劑測定；頂空平衡30時間 min和40 min時，各峰響應接近，最終確定頂空條件為：平衡溫度100℃，平衡時間30 min。

3.3 小結

二甲苯、二乙基苯和二乙烯基苯為多種異構體比例固定混合物， 查閱現有文獻發現二甲苯可以檢測到對二甲苯和鄰二甲苯2個峰，二乙基苯及二乙烯基苯一般只能檢測到2個峰，本文采用頂空氣相色譜法測定黃芪提取物中大孔樹脂有機溶劑殘留物，靈敏度很高，在色譜圖中二甲苯、二乙基苯和二乙烯基苯分別表現為2個峰、3個峰和4個峰，在計算峰面積時候以峰面積總和作為上述各溶劑峰面積進行計算。

參 考 文 獻

[1] 范偉贏，王柏章.大孔吸附樹脂分離法對提純中藥有效成分影響因素[J].廣東醫學院學報，2008，26（5）：544-546.

[2] 周福軍，劉振國，單淇，等.頂空氣相色譜法測定阿可拉定（IC162）中大孔樹脂有機溶劑殘留物[J].藥物評價研究，2010，33（6）：424-427.

[3] 中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].二部.中國醫藥科技出版社，2010，附錄Ⅷ P 殘留溶劑測定法：61-65.

[4] 劉東，楊敏芝，杜守穎.頂空氣相色譜法測定大孔樹脂提取物中殘留溶劑研究[J].藥物分析雜志，2009（11）：1877-1880.

[5] 楊婷婷，金松子，李萍萍，等. 頂空氣相色譜法測定YP215中大孔樹脂殘留溶劑[J].現代儀器，2012（5）： 18-20.

[6] 楊玲， 王英鋒， 郭雪清，等. 頂空氣相色譜法檢測黃芩提取物中D-101大孔樹脂有機溶劑殘留物[J].藥物分析雜志，2008，28（5）：814-816.

[7] 李麗敏，錢大公，王柯，等. 頂空氣相色譜法測定三七葉苷中大孔樹脂有機溶劑殘留物[J].藥物分析雜志，2007，27（5）：738-741.

[8] 全紅娜，金松子，商國舉，等. 頂空氣相色譜法測定降膽固醇藥YA中殘留溶劑量[J].現代儀器與醫療，2015（1）：67-69.

[9] 段續，蔡振華，楊婷婷，等. 頂空氣相色譜法測定萜類物質（Y211）中甲醇和石油醚[J].現代儀器與醫療，2013（1）：79-81.

[10] 武曉靜，徐慧，莊件兵，趙厚民. 氣相色譜法測定甲磺酸胺銀杏內酯B中大孔樹脂有機溶劑殘留[J].化學分析計量，2011，20（1）：51-53.