顆粒蛋白前體在皮膚鱗癌A431細胞中的表達及其作用研究

宋穎劼，劉明章，鐘華杰，陸群英，戴利成

顆粒蛋白前體在皮膚鱗癌A431細胞中的表達及其作用研究

宋穎劼，劉明章，鐘華杰，陸群英，戴利成

目的探討顆粒蛋白前體（PGRN）在皮膚鱗癌A431細胞中的表達及其對生長轉移的調控作用。方法構建PGRN干擾細胞株，通過增殖（CCK-8）實驗和侵襲（Trans-well）實驗分別研究PGRN在皮膚鱗癌A431細胞的增殖和侵襲中的作用，探討PGRN在皮膚鱗癌生長及轉移中的意義。結果成功構建了PGRN-shRNA-A431細胞株，并通過CCK-8實驗和Trans-well實驗驗證了干擾PGRN后對皮膚鱗癌A431細胞的生長及侵襲具有抑制作用。結論PGRN在皮膚鱗癌A431細胞中表達，并與皮膚鱗癌的發生、發展密切相關。

顆粒蛋白前體；皮膚鱗癌；A431細胞

皮膚癌為臨床常見的惡性腫瘤之一，為白種人常見的惡性腫瘤，甚至超過其他惡性腫瘤的總和。流行病學調查表明：由于臭氧層的破壞和人們戶外活動的增多，皮膚癌的發病率呈逐年上升的趨勢，僅在美國每年新診斷皮膚癌患者約130萬例[1]，在澳大利亞南部地區，皮膚癌的發病率達650/10萬，在美國的高加索人中，皮膚癌的發病率亦高達165/10萬[2]。本研究觀察顆粒蛋白前體（PGRN）在皮膚鱗癌細胞 A431中的表達及其與皮膚鱗癌細胞增殖和遷移的相關性?，F報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料細胞培養：人皮膚鱗癌細胞A431，人胚腎細胞293T購自中國科學院上海細胞庫。胎牛血清（FBS）、D MEM培養基、0.025%胰蛋白酶、青鏈霉素和嘌呤霉素均購自美國Gibco公司。

1.2方法A431細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，置5%CO2的37℃培養箱中培養。

1.2.1shRNA干擾病毒的構建與包裝

本實驗針對PGRN序列設計shRNA序列克隆至帶有 EGFP報告基因的GV248載體進行病毒載體構建。將構建成功的慢病毒表達質粒PGRN-shRNAGV248與其他兩種輔助包裝原件載體質粒、三種質粒載體分別進行高純度無內毒素抽提，按Invitrogen公司Lipofectamine2000使用說明進行共轉染293T細胞。293T細胞培養于DMEM培養基中，轉染前24 h，用胰蛋白酶消化對數生長期的293T細胞，接種于10 cm細胞培養皿，37℃，5%CO2培養箱內培養。轉染前2 h將細胞培養基更換為無血清培養基。將質粒DNA轉染至293T細胞中，于37℃，5%CO2細胞培養箱中培養。培養8h后倒去含有轉染混和物的培養基，PBS液洗滌一次，更換為含10%血清的細胞培養基，于37℃、5%CO2培養箱內繼續培養48 h，熒光顯微鏡下觀察報告基因GFP的表達。收集轉染后48 h的293T細胞上清液，將病毒濃縮液移出，分裝后保存在病毒管中，－80℃長期保存。

1.2.2shRNA干擾PGRN穩轉細胞系的構建PGRN抗體及GAPDH抗體均購自美國SantaCruze公司，穩轉細胞株按照說明書操作。PGRN及GAPDH抗體 A431細胞培養于含 10%FBS的DMEM 培養液中至對數生長期，用0.025%的胰蛋白酶消化，按5×105個細胞/ml接種于12孔板中，培養過夜后按照MOI 20感染A431細胞，同時設立對照組，48 h后，將培養基換成含5g/ml嘌呤霉素的新鮮培養基進行細胞篩選，以后隔天更換含5g/ml嘌呤霉素的新鮮培養基，10～12 d后，0.025%的胰蛋白酶消化細胞，將其按1個細胞/100l培養液接種于96孔板，1周后，挑選單克隆株，繼續擴大培養。Western Blot鑒定陽性克隆株，并挑選生長良好的單克隆株凍存及用于后續實驗。

1.2.3細胞增殖實驗A431細胞培養于含10%FBS的DMEM培養液中，用0.025%的胰蛋白酶分別消化對數生長期的 PGRN-shRNA-A431細胞、ControlshRNA-A431細胞及A431細胞，以每孔5×103個細胞接種于96孔培養板中，每孔體積為100 l，各組細胞分別做6個復孔。將培養板放入37℃、5%CO2培養箱中，48h后，每孔加入MTT溶液（5mg/ml）10l，在37℃細胞培養箱中繼續孵育4h，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液。每孔加入150 l DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分溶解。選擇490 nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔吸收值，記錄結果。

1.2.4細胞侵襲實驗A431細胞培養于含10%FBS的DMEM培養液中，按照24孔比色法檢測細胞侵襲能力試劑盒[QCMTM24-Well Colorimetric Cell InvasionAssayKit（CHEMICON）]的說明書要求進行操作，用0.025%的胰蛋白酶分別消化對數生長期的PGRN-shRNA-A431細胞、Control-shRNA-A431細胞及A431細胞，將細胞按5×105/ml接種于小室，48h后，對細胞進行染色，在普通倒置顯微鏡下觀察細胞遷移情況，并檢測細胞裂解液在560 nm下的吸光值，對其定量。

1.3統計方法采用SPSS18.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用-檢驗。＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1PGRN干擾細胞株PGRN-shRNAA431的構建及鑒定通過慢病毒感染及嘌呤霉素篩選，成功得到A431被干擾的穩定細胞株PGRN-shRNA-A431。抽提細胞蛋白后，通過WesternBlot驗證了PGRN的表達，PGRN-shRNA-A431細胞株幾乎不表達PGRN蛋白（封四彩圖3）。

2.2PGRN促進A431細胞的增殖和侵襲

通過CCK-8實驗，PGRN-shRNA-A431細胞吸光值（0.325±0.05）與 ControlshRNA-A431細胞（0.768±0.12）和A431細胞（0.785±0.15）比較，其細胞增殖效率發生顯著降低（均＜ 0.05），而 ControlshRNA-A431細胞和A431細胞比較，其細胞增殖率差異無統計學意義（＞0.05）。

通過細胞遷移實驗，PGRN-shRNAA431細胞吸光值（0.125±0.013）與ControlshRNA-A431細胞（0.232±0.042）和A431細胞（0.257±0.028）比較，其細胞侵襲效率發生顯著降低（＜0.05）（封四彩圖4），而ControlshRNA-A431細胞和A431細胞比較，其細胞侵襲率差異無統計學意義（＞0.05）。

3　討論

皮膚癌主要分為3種：基底細胞癌、鱗狀細胞癌和惡性黑色素瘤，其中基底細胞癌最多見，占60%以上，鱗狀細胞癌約占30%，平常所說的皮膚癌主要是指這兩種[3]。皮膚癌的發病率雖然逐年上什，但目前臨床治療方法仍存在許多弊端，如激光外科雖操作簡單，費時少，但其費用高，而且有時不易掌握破壞范圍，易導致正常組織損傷和治療不徹底易復發等；冷凍外科本身雖不會帶來疼痛，但解凍后的組織易產生疼痛、腫脹和滲出等炎性反應，形成瘢痕；目前臨床常用的40種化療藥物靶向性低且選擇性不強，在殺傷大部分腫瘤細胞的同時對正常組織細胞殺傷作用也較大。因此，尋找一種新的防治皮膚癌的方法是廣大醫學工作者的當務之急。

許多研究發現，大部分器官中都有PGRN基因的表達，包括皮膚組織、胃腸道系統、女性生殖器官和乳腺上皮組織等[4]。研究發現PGRN蛋白在多種腫瘤細胞，如乳腺癌細胞[5]、卵巢癌細胞[6]、腎上腺皮質瘤細胞[7]和前列腺癌細胞[8]中，都有明顯的高表達，它在調解腫瘤細胞的生長、增強細胞侵襲能力和促進腫瘤組織血管形成等方面發揮重要作用，提示PGRN可能成為腫瘤治療的良好靶點。

本研究發現，PGRN在皮膚鱗癌細胞A431中表達顯著，因此推測其可能對皮膚鱗癌細胞的生長和侵襲具有重要作用。因此，構建成功了PGRN的干擾病毒，并將此病毒感染A431細胞，從而獲得了PGRN干擾的A431穩定表達細胞株，通過該細胞模型研究PGRN在A431生長過程中調控作用。通過細胞增殖實驗，筆者發現，PGRN干擾后，A431細胞的生長受到明顯的抑制，與未處理A431細胞相比較，其增殖抑制率達到58.6%，而對照病毒處理組與未處理的A431細胞相比較，增殖抑制率無顯著差異。而通過細胞侵襲實驗，筆者還發現，PGRN干擾后，A431細胞的侵襲能力也發生了顯著的降低，與未處理的A431細胞相比較，其侵襲抑制率達到51.4%，而對照病毒處理組與與未處理的A431細胞相比較，侵襲抑制率無顯著差異。

PGRN促進腫瘤細胞增殖、調節炎癥反應等作用受到細胞內外信號的嚴密控制。當細胞外因素刺激或細胞本身的生理功能發生變化時，PGRN可通過多條信號傳導途徑發揮其生理功能。目前，大量研究表明，PGRN主要通過以下幾條信號通路發揮作用：（1）SHC和P44/42MAPK參與的胞外調節激酶信號傳導途徑[7]；（2）PI3K、PKB/AKT和P70s6kinase參與的 PI3K信號傳導途徑。PGRN主要通過以上兩條信號傳導途徑發揮其促進細胞增殖的功能[8]；PGRN還可以促使粘著斑激酶（FAK）上的酪氨酸磷酸化[9]。FAK主要參與調節整合素以及細胞骨架蛋白的信號通路，因此，PGRN通過活化FAK，從而激活整合素信號傳導通路，發揮其促進腫瘤細胞遷移和抵抗失巢凋亡的功能。

目前PGRN在皮膚組織中的研究報道還很少，PGRN在表皮細胞中有表達，在皮膚癌細胞A431中高表達。但是，其具體的作用及調控機制還不是很明確。因此，研究PGRN在皮膚癌細胞生長中的作用，探索其調控細胞生長的機制，對于進一步了解PGRN在皮膚生長發育及皮膚癌生長轉移中的作用機制具有重要意義。

[1]Rogers HW,Coldiron BM.Analysis of skin cancer treatment and costs in the United States Medicare population,1996-2008[J].Dermatol Surg,2013,39:35-42.

[2]Olsen CM,Williams PF,Whiteman DC. Turning the tide Changes in treatment rates for keratinocyte cancers in Australia 2000 through 2011[J].J Am Acad Dermatol,2014,71(1):21-26.

[3]Plikus MV,Van Spyk EN,Pham K,et al. The Circadian clock in skin:implications for adult stem cells,tissue regeneration, cancer,aging,and immunity[J].J Biol Rhythms,2015,30(3):163-182.

[4]Jian J,Konopka J,LiuC.Insights into the role of progranulinin immunity,infection, andinflammation[J].JLeukocBiol,2013, 93(2):199-208.

[5]SwamydasM,Nguyen D,AllenLD,et al. Progranulin stimulated by LPA promotes the migration of aggressive breast cancer cells[J].Cell Commun Adhes,2011,18 (6):119-130.

[6]Simpkins FA,Devoogdt NM,Rasool N, et al.The alarm anti-protease,secretory leukocyte protease inhibitor,is a proliferation and survival factor for ovarian cancer cells[J].Carcinogenesis,2008,29(3): 466-472.

[7]Donald CD,Laddu A,Chandham P,et al. Expression of progranulin and theepithelin/granulin precursor acrogranin correlates with neoplastic state in renal epithelium[J].Anticancer Res,2001,21:3739-3742.

[8]Tanimoto R,Morcavallo A,Terracciano M,et al.Sortilin regulates progranulin action in castration-resistant prostate cancer cells[J].Endocrinology,2015,156(1): 58-70.

[9]PizarroGO,ZhouXC,KochA,et al.Prosurvival function of the granulin-epithelin precursorisimportantintumorprogression and chemoresponse[J].Int JCancer,2007, 120(11):2339-2343.

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.05.052

R365；R75

A

1671-0800(2016)05-0661-02

2016-01-10

（本文編輯：陳志翔）

浙江省湖州市科技局一般項目（2012YS09）

313000，浙江省湖州，湖州市中心醫院

宋 穎 劼，Email：songyingjiehz@126.com