人表皮生長因子受體2、核因子-κB及血管內皮生長因子在胃癌組織中的表達及其臨床意義▲

文亦磊 歐海玲 賴燕燕 崔錦珠

(1 廣西中醫藥大學第一附屬醫院病理科，南寧市 530023，E-mail：wenyilei@aliyun.com；

論著·臨床研究

人表皮生長因子受體2、核因子-κB及血管內皮生長因子在胃癌組織中的表達及其臨床意義▲

文亦磊1歐海玲1賴燕燕2崔錦珠1

(1 廣西中醫藥大學第一附屬醫院病理科，南寧市 530023，E-mail：wenyilei@aliyun.com；

2 廣西衛生職業技術學院遺傳學教研室，南寧市 530023)

目的 探討胃癌組織中人表皮生長因子受體2(HER-2)、核因子-κB(NF-κB)及血管內皮生長因子(VEGF)的表達情況及其臨床意義。方法 應用免疫組織化學方法(S-P法)檢測126例胃癌組織、54例正常胃黏膜組織中HER-2、NF-κB及VEGF蛋白表達情況，分析三者的相關性及其表達與胃癌臨床病理特征間的關系。結果 (1)胃癌組織中HER-2高表達率為21.4%(27/126)，NF-κB及VEGF蛋白的陽性表達率分別為53.9%(68/126)、58.7%(74/126)，均明顯高于正常胃黏膜組織(P<0.05)；(2)低分化胃癌組、淋巴結轉移組、TNM Ⅲ+Ⅳ期組患者的胃癌標本中HER-2蛋白高表達率較高(P<0.05)；低分化胃癌組、漿膜或漿膜外浸潤組、TNM Ⅲ+Ⅳ期組患者的胃癌標本中NF-κB蛋白陽性率較高(P<0.05)；漿膜或漿膜外浸潤組、淋巴結轉移組、TNM Ⅲ+Ⅳ期組患者的胃癌標本中VEGF蛋白陽性率較高(P<0.05)。(3)胃癌組織中HER-2與NF-κB、HER-2與VEGF、NF-κB與VEGF表達均呈正相關性(P<0.05)。結論 胃癌組織中HER-2、NF-κB及VEGF的陽性表達增高。HER-2可激活NF-κB以影響胃癌的發展和預后，激活VEGF可促進腫瘤的生長與轉移，三者的協同作用對于研究胃癌的信號傳導網絡及分子靶向藥物治療有重要意義。

胃癌；人表皮生長因子受體2；核因子-κB；血管內皮生長因子；免疫組織化學

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤，其死亡率居全世界癌癥死亡率的第二位[1]。我國每年新增胃癌患者80萬人，每年死于胃癌的人數約16萬人，死亡率為25.16/10萬，無論是發病率還是死亡率胃癌均居惡性腫瘤的前列。大多數患者來院就診時，已處在進展期或晚期，雖然可通過手術、放療、化療等措施進行治療，但治療效果不理想。近年來，隨著分子生物學與病理學的交叉融合，對胃癌發病機制及治療的研究已經達蛋白、基因水平。人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)基因擴增可增強酪氨酸激酶活性，再通過對多條途徑的作用而影響細胞的增殖、轉化和凋亡，從而在腫瘤的發生發展中起到重要作用[2]。核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是信號傳導通路中重要的上游因子，主要在調控細胞增殖、分化和凋亡等方面發揮作用，NF-κB失調涉及腫瘤發生發展和耐藥[3]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是內皮細胞特異性的有絲分裂原，能促進內皮細胞的分裂增殖，促進血管和淋巴管的生成，對腫瘤的轉移產生影響[4]。本文采用免疫組化方法檢測HER-2、NF-κB和VEGF在胃癌組織中的表達情況，以了解三者之間的相關性及其與胃癌臨床病理特征的關系，并探討三者影響胃癌發生發展的可能機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇廣西中醫藥大學第一附屬醫院2009年1月至2015年10月收治胃癌患者126例，獲取其手術切除并經病理檢測證實為胃癌的蠟塊標本。納入標準：病理類型均為腺癌，臨床及病理資料完整。排除標準：術前進行放療、化療者。其中男性71例，女性55例；年齡34～86歲，中位年齡57歲；58例腫瘤直徑<5 cm，68例腫瘤直徑≥5 cm；根據分化程度：高-中分化59例，低分化67例；浸潤深度為浸潤黏膜層、黏膜下層或肌層者44例，浸潤漿膜層或漿膜外者82例；有淋巴結轉移者74例，無淋巴結轉移者52例；臨床TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期51例，Ⅲ～Ⅳ期75例。另選54例正常胃黏膜作為對照組，納入標準：輕-中度慢性胃炎中的胃鏡活檢組織。排除標準：經病理檢測為不典型增生及腸上皮化生者。其中男性21例，女性23例；年齡29～80歲，中位年齡58歲。

1.2 主要試劑及檢測方法 鼠抗人HER-2、NF-κB 及VEGF單克隆抗體均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。免疫組織化學法采用S-P法。標本使用10%甲醛溶液固定過夜，石蠟包埋后5 μm厚切片。選取1張常規采用蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色進行病理診斷，另外3張進行免疫組化檢測。切片常規脫蠟水化后，檸檬酸高壓修復，3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶，其余步驟按試劑盒說明進行操作。用磷酸緩沖鹽溶液替代一抗作為陰性對照，用已知陽性片作為陽性對照。

1.3 結果判讀

1.3.1 HER-2的判讀：采用Hofmann等[5]推薦的胃癌HER-2蛋白檢測評分標準：陽性著色為棕黃色信號定位于細胞膜；無著色或<10%腫瘤細胞膜著色為0/陰性；≥10%腫瘤細胞呈微弱、不完整的細胞膜著色為+/陰性；≥10%腫瘤細胞呈弱至中等強度完整的細胞膜著色為2+/不確定；≥10%腫瘤細胞呈強的、完整的細胞膜著色為3+/陽性。其中0和+視為低表達，2+和3+視為高表達。

1.3.2 NF-κB和VEGF的判讀采用半定量法[6]：NF-κB陽性表達部位為胞質和(或)胞核；VEGF陽性表達部位為胞質。先根據細胞的染色范圍計分，陽性細胞數<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分；再根據陽性細胞染色強度計分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；最后根據兩者相加所得的總分進行結果判讀：<3分為陰性(-)，≥3分為陽性(+)。

1.4 統計學分析 應用SPSS 21.0軟件進行統計學分析，計數資料采用χ2檢驗，相關性分析采用秩相關分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HER-2、NF-κB、VEGF在胃癌組織和正常胃黏膜中的表達 胃癌組織中HER-2呈高表達，NF-κB及VEGF均呈陽性表達，見圖1、圖2、圖3。胃癌組的HER-2高表達率、NF-κB及VEGF陽性表達率明顯高于正常胃黏膜組(P<0.05)，見表1。

圖1 胃癌中HER-2高表達(S-P染色，×200)圖2 胃癌中NF-κB的表達(S-P染色，×200) 圖3 胃癌中VEGF的表達(S-P染色，×200)

表1 兩組HER-2、NF-κB、VEGF陽性率比較(n)

2.2 HER-2、NF-κB、VEGF表達與胃癌臨床病理特征的關系 低分化胃癌組、淋巴結轉移組、TNM Ⅲ+Ⅳ期組患者的胃癌標本中HER-2蛋白高表達率較高(P<0.05)；低分化胃癌組、漿膜或漿膜外浸潤組、TNM Ⅲ+Ⅳ期組患者的胃癌標本中NF-κB蛋白陽性率較高(P<0.05)；漿膜或漿膜外浸潤組、淋巴結轉移組、TNM Ⅲ+Ⅳ期組患者的胃癌標本中VEGF蛋白陽性率較高(P<0.05)。見表2。

表2 HER-2、NF-κB、VEGF表達與胃癌臨床病理特征的關系

2.3 胃癌組織中HER-2、NF-κB、VEGF表達的關聯性 胃癌組織中HER-2與NF-κB呈正相關(r=0.288，P=0.01)，HER-2與VEGF表達呈正相關(r=0.202，P=0.02)，NF-κB與VEGF表達呈正相關(r=0.293，P=0.001)。

3 討 論

HER-2是表皮生長因子受體家族成員之一，能通過多種途徑參與細胞內的信號轉導。HER-2可以通過絲裂原活化蛋白激酶和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶兩種途徑分別上調周期素D1和環氧酶-1的表達，抑制細胞凋亡并使細胞進入永生狀態，從而在腫瘤的發生發展階段發揮重要作用[7]。本實驗中胃癌組織高表達HER-2蛋白(21.4%)，而正常組織無HER-2蛋白表達(0%)，進一步證實HER-2基因激活為胃癌發生始動因素之一的觀點。另外，HER-2還可以增強基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2、MMP-7、MMP-9降解細胞外基質的能力，從而促進腫瘤的浸潤和轉移，本研究結果亦顯示，淋巴結轉移病例的HER-2高表達率(28.4%)高于無淋巴結表達病例(11.5%)(P<0.05)。有研究表明，HER-2基因的擴增和過表達與較低的中位生存期及較差預后具有相關性[8-9]，而本實驗中低分化胃癌病例和Ⅲ、Ⅳ期病例的HER-2高表達率分別高于高分化胃癌和Ⅰ、Ⅱ分期的病例(P<0.05)。這提示HER-2蛋白可能與胃癌分化程度、淋巴結轉移和TNM分期有關，表明HER-2基因可作為預測胃癌預后的指標之一，并提示該基因的擴增和過表達在胃癌發生發展中扮演了重要的角色。

NF-κB是一種廣泛存在于真核細胞中的多效核轉錄因子，參與炎癥、免疫反應、細胞增殖與凋亡等多種病理生理過程的基因調控。Makino等[10]的研究發現HER-2蛋白可以通過Pi3k-Akt途徑激活NF-κB的表達，被激活的NF-κB進入胞核后可以通過以下方式抑制細胞凋亡，促進腫瘤的發生：(1)通過激活B細胞淋巴瘤-2蛋白發揮抗凋亡作用；(2)通過上調C-IAP的表達，從而抑制半胱天冬酶-8的活化，阻止凋亡的發生；(3)通過調控各種細胞因子的表達而間接抑制細胞凋亡的發生。本研究結果表明，胃癌組織中HER-2與NF-κB的表達呈正相關，與安杰等[11]的研究一致，這提示HER-2作為上游的調控因子，可激活NF-κB的表達，兩者發生協同效應，從抗凋亡、細胞永生、腫瘤浸潤及轉移等方面共同促進了胃癌的發生發展。本研究發現NF-κB在低分化胃癌組、漿膜或漿膜外浸潤組、TNM Ⅲ+Ⅳ期組患者的胃癌標本中NF-κB蛋白陽性率較高(P<0.05)，提示NF-κB與胃癌分化程度、浸潤深度和TNM分期有關，其作為一個核心調控位點，對腫瘤的發展、預后有重要的影響，也為后續胃癌的基因靶向治療研究提供了一個參考位點。

VEGF是作用最強、特異性最高的血管生成因子之一，其本身不能促進癌細胞的增殖，但能通過刺激淋巴管、血管的內皮細胞增殖、遷移和管腔形成在腫瘤生長和發展中起重要作用[12]，本研究發現VEGF在漿膜或漿膜外浸潤組、淋巴結轉移組、TNM Ⅲ+Ⅳ期組患者的胃癌標本中VEGF蛋白陽性率較高(P<0.05)，提示VEGF蛋白與浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期有關，可能涉及的機制包括[13]：(1)誘導內皮細胞產生基質金屬蛋白酶和組織因子，促進基底膜的降解，為腫瘤細胞的轉移提供條件；(2)增強血管通透性，促進血漿纖維蛋白外滲為其他細胞的遷移提供一個網絡支架；(3)能夠促進癌旁血管、淋巴管的生成，利于癌細胞轉移。VEGF可以被Akt途徑激活[4]，而HER-2及NF-κB正是Akt途徑的上游調控基因，因此HER-2與VEGF、NF-κB與VEGF均具有相關性(P<0.05)，這與本實驗的研究結果一致。

雖然手術與化療使胃癌患者的生存率有所提高，但其預后仍不理想，特別是中晚期胃癌患者的5年生存率仍然很低。而通過分子靶向治療，可以針對性的抑制腫瘤細胞生長、增殖，從而有效控制腫瘤的發展、浸潤。聯合檢測HER-2、NF-κB、VEGF在胃癌組織中的表達，能為胃癌的分子靶向藥物治療提供客觀、科學的依據，同時這些指標也可以作為判斷胃癌患者預后、篩選高危轉移患者的有效指標。隨著對胃癌在分子水平發生發展的深入研究，逐步明確胃癌細胞信號傳導網絡中的重要指標或節點，針對這些重要指標或節點的多靶點聯合治療理念的實現，胃癌治療將會進入一個精確、高效的全新境界。

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Expressions and clinical significance of human epidermal growth factor receptor-2,nuclear factor-κB and vascular endothelial growth factor in gastric carcinoma tissues

WENYi-lei1,OUHai-ling1,LAIYan-yan2,CUIJin-zhu1

(1DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530023,China;2DepartmentofGenetics,GuangxiMedicalCollege,Nanning530023,China)

Objective To investigate the expressions and clinical significance of human epidermal growth factor receptor-2(HER-2),nuclear factor-κB(NF-κB) and vascular endothelial growth factor(VEGF) in gastric carcinoma tissues.Methods The expressions of HER-2,NF-κB and VEGF proteins were detected by immunohistochemistry(S-P method) in 126 gastric carcinoma tissues and 54 normal gastric mucosa tissues.The correlation of the three proteins,and the relationship of the protein expressions with clinical and pathological characteristics of gastric carcinoma were analyzed.Results ① In gastric carcinoma tissues,the overexpression rate of HER-2 was 21.4%(27/126),the positive expression rates of NF-κB and VEGF protein were 53.9%(68/126) and 58.7%(74/126) respectively,which were significantly higher than those in normal gastric mucosa(P<0.05).② The overexpression rates of HER-2 protein in gastric carcinoma specimens were higher in the poorly differentiated gastric carcinoma group,lymphatic metastasis group and TNM stage Ⅲ+Ⅳ group(P<0.05).The positive expression rates of NF-κB protein in gastric carcinoma specimens were higher in the poorly differentiated group,serosal or subserosal infiltration group and TNM stage Ⅲ+Ⅳ group(P<0.05).The positive expression rates of VEGF protein in gastric carcinoma specimens were higher in serosal or subserosal infiltration group，lymphatic metastasis group and TNM stage Ⅲ+Ⅳ group(P<0.05).③ In gastric carcinoma tissues,the expression of HER-2 positively correlated with the expression of NF-κB or VEGF,and positive correlation also existed between NF-κB and VEGF expressions(P<0.05).Conclusion The positive expressions of HER-2,NF-κB and VEGF increase in the gastric carcinoma tissues.HER-2 can activate NF- κB to affect the development and prognosis of gastric cancer,and activate VEGF to promote the growth and metastasis of tumor.The synergistic effect of HER-2,NF-κB and VEGF has a great significance in the study of signal transduction network and molecular-targeted drug therapy for gastric cancer. 【Key words】 Gastric carcinoma,Human epidermal growth factor receptor-2,Nuclear factor-κB,Vascular endothelial growth factor,Immunohistochemistry

廣西高?？茖W技術研究項目(LX2014175)

文亦磊(1982～)，男，博士，副主任醫師，研究方向：腫瘤病理的臨床、基礎研究及病理教學。

R 735.2

A

0253-4304(2016)01-0031-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.01.10

2015-11-07

2015-12-25)