肝細胞熱缺血及再灌注損傷的機制研究現狀▲

李文川 浦 澗

(1 右江民族醫學院研究生學院，百色市 533000，E-mail：361666122@qq.com；2 右江民族醫學院附屬醫院肝膽外科，百色市 533000)

綜 述

肝細胞熱缺血及再灌注損傷的機制研究現狀▲

李文川1浦 澗2

(1 右江民族醫學院研究生學院，百色市 533000，E-mail：361666122@qq.com；2 右江民族醫學院附屬醫院肝膽外科，百色市 533000)

肝細胞熱缺血及再灌注損傷(WIRI)是肝臟手術或肝移植中常見的病理生理變化，其顯著影響患者術后恢復。WIRI的機制仍未完全明確，并且缺乏有效的預防和治療策略。多種因素和途徑參與WIRI過程，如氧化應激、Kupffer細胞活化、CD4+T細胞激活、細胞因子激活、中性粒細胞聚積和激活，最終可導致肝細胞損傷、凋亡和壞死、再生減少。本文對肝細胞WIRI的機制及其研究現狀進行綜述。

熱缺血及再灌注損傷；肝細胞；發生機制；細胞死亡；細胞再生；綜述

肝細胞熱缺血及再灌注損傷(warm ischemia-reperfusion injury，WIRI)是肝臟手術和肝移植的常見障礙，其可影響肝臟術后余肝再生、供肝活力及肝功能恢復。肝移植已被公認為是一種有效治療終末期肝病的方法以及標準肝癌的外科治療選擇[1]。隨著移植的技術進步及免疫抑制治療方案的改善，肝移植逐年遞增，移植器官嚴重短缺，而導致越來越多地使用無心跳“邊緣”供體，WIRI不可避免地成為移植術后原發性無功能和原發性移植物延遲功能的主要危險因素[2]。臨床上，熱缺血及再灌注引起的損傷程度直接影響肝臟手術和肝移植患者的總體情況，增加術后并發癥的發生率和死亡率；此外，也影響失血性休克及感染性休克患者的搶救成功率。因此，了解WIRI的機制，有助于臨床上預防和減少WIRI。現對肝細胞WIRI的機制及其研究現狀進行綜述。

1 缺血-再灌注(ischemia-reperfusion，IR)引起WIRI發生的機制

WIRI是在肝臟手術肝移植、失血性休克及感染性休克等情況中常見的病理生理變化，可引起組織、器官功能障礙和衰竭。既往研究發現，肝細胞在WIRI中較為敏感，而肝竇內皮細胞在冷缺血及再灌注損傷中較敏感[3]。肝細胞WIRI是復雜且動態的病理生理過程，其發生機制主要涉及氧化應激、Kupffer細胞(Kupper cell，KC)活化、CD4+T細胞激活、細胞因子激活、中性粒細胞累積和激活，最終導致肝細胞損傷、凋亡和壞死、再生減少。

1.1 氧化應激作用 肝臟作為高能量需求的器官，高度依賴于供氧并且易受低氧或缺氧條件的影響[4]。熱缺血時，肝細胞內外三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)耗竭，導致ATP降解產物增加；再灌注復氧后，產生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)。肝細胞WIRI時ROS生成增多的主要機制[5]：(1)熱缺血-再灌注時，黃嘌呤脫氫酶轉換成黃嘌呤氧化酶，釋放出大量電子，O2接受后使ROS大量增多。(2)在還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶的催化下，O2接受電子形成氧自由基，這個過程稱為氧爆發或呼吸爆發。(3)線粒體氧化磷酸化功能障礙，電子傳遞鏈解耦聯，形成的氧自由基增多。ROS直接損傷組織并激活有害細胞級聯應答，導致炎癥、細胞死亡、功能障礙[6]。氧化應激過程中ROS的產生也可充當信號分子介導細胞內的信號轉導途徑[7]。氧化應激通過多種機制損傷肝細胞，包括脂質過氧化、DNA損傷和酶變性[8-9]。在WIRI早期階段，氧化應激作用引起損害發生并激活炎癥通路，導致中性粒細胞聚積在后期階段[10]。

1.2 KC活化作用 KC是肝臟血竇內最大的定居巨噬細胞群，參與了肝臟對感染、毒素、局部缺血、切除術及其他應激的反應[11]，并且是涉及WIRI最早階段的關鍵細胞類型。脈管系統中KC的激活導致ROS的生成，從而引起氧化應激[12]。同時KC活化也釋放細胞因子和趨化因子，如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白細胞介素(interleukin，IL)-1、IL-12等，后者通過多種機制介導肝臟本身和遠程器官的損傷；上調促炎性細胞因子、趨化因子和黏附因子，導致中性粒細胞在肝臟聚集，引起肝細胞WIRI進一步加重。此外，補體系統參與KC誘導氧化應激，促進ROS產生的啟動和中性粒細胞在再灌注期間累積[13-14]。Giakoustidis等[15]的實驗研究表明，應用抑制劑氯化釓阻斷KC的活化作用可減輕肝臟WIRI。

1.3 CD4+T細胞的招募和激活作用 在再灌注早期階段，肝臟WIRI中的CD4+T細胞被激活并招募到肝血竇，具有雙重作用，是否有助于損傷或減少損傷程度，取決于細胞活化的CD4+亞型和機制。IL-1和TNF-α招募并激活CD4+T淋巴細胞，其產生TNF-β、TNF-γ、干擾素-γ(interferon gamma，INF-γ)和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子。這些細胞因子增強KC的活化，分泌TNF-α和IL-1，促進中性粒細胞募集并黏附到肝血竇，從而在激活過程中產生某些循環模式[16]。Lu等[17]發現在70%肝熱缺血再灌注模型中，再灌注24 h后行調節性T細胞(Treg細胞)治療顯著降低血清谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶，并使INF-γ和IL-17表達顯著下降，表明Treg細胞具有通過阻止炎性細胞因子的釋放，改善肝臟WIRI的生化作用。Li等[18]的研究發現誘導性調節T細胞可誘發T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子4的阻斷作用，有效改善WIRI。

1.4 細胞因子激活作用 多種細胞因子參與WIRI的病理生理過程，如炎癥介質TNF-α、IL-1、IL-6、血小板活化因子和細胞間黏附分子-1(intracellular adhesion molecule-1，ICAM-1)以及補體等。這些細胞因子通過多種途徑對肝細胞產生損傷。細胞因子誘導的中性粒細胞趨化因子可能是鏈接WIRI早期階段的KC活化和晚期階段由中性粒細胞介導WIRI的關鍵因素[19]。在IR損傷中，通過膜攻擊復合物(C5b-C9)的形成沉積作用激活補體可直接或間接地活化細胞因子和趨化因子[20]。TNF-α是WIRI中最為重要的因子，它可導致血管內皮細胞的黏附分子表達，并刺激趨化因子，引起中性粒細胞的募集而釋放出更多的活性氧和蛋白酶，產生進一步的損傷[21]。此外，TNF-α也可刺激KC產生更多的TNF-α。但TNF-α誘導肝細胞損傷的潛在機制尚未完全明確。TNF-α可能對線粒體產生的直接毒性，造成細胞壞死或細胞凋亡。同時，有研究發現中斷TNF-α的釋放可減輕肝損傷和增加肝再生[22]。IL-1可通過上調中性粒細胞促進ROS產生，進而加重損害。IL-1還可促使TNF-α產生，而TNF-α亦會引起IL-1釋放。WIRI期間，IL-6釋放也參與損傷過程。Camargo等[23]發現延遲釋放IL-6對大鼠WIRI有保護作用。

1.5 中性粒細胞聚積和激活作用 肝臟WIRI后期階段主要是炎性作用失調誘導中性粒細胞聚積。中性粒細胞激活參與WIRI相關聯的肝微血管功能障礙和實質損傷[24]。中性粒細胞引發和活化ROS形成的過程，涉及補體因子、損傷相關分子模式和DNA片段，促使ROS啟動增強[25]。趨化因子通過肝組織內趨化因子梯度作用，在缺血損傷區有助于吸引中性粒細胞；而中性粒細胞所需要的黏附分子如ICAM-1、整合素等，通過細胞-細胞間相互作用從血流轉移到損傷區上[6]。炎性細胞和黏附分子在WIRI后期階段占主導地位，可募集并激活中性粒細胞，其接觸和黏附到內皮細胞，跨內皮移動，隨后附著并損傷實質細胞[19]。中性粒細胞激活和聚積在WIRI中的作用有：(1)中性粒細胞通過顆粒胞吐作用釋放蛋白酶和其他細胞酶，這些酶能降解細胞膜和基質成分。抑制中性粒細胞彈性蛋白酶，可破壞細胞外基質，降低肝損傷[26]。(2)中性粒細胞激活后可顯著促進ROS釋放到肝實質中，通過煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶依賴途徑產生ROS引起肝實質損傷，并通過固有抗蛋白酶失活促進蛋白酶介導的損傷。(3)中性粒細胞和血小板黏附于內皮細胞，通過選擇素家族介導導致血小板黏附和肝損傷。Junnarkar等[27]實驗研究發現，使用布西拉明抑制中性粒細胞激活和調節B淋巴細胞瘤-2相關X蛋白/B淋巴細胞瘤-2表達可減少肝細胞WIRI。

2 IR致WIRI中肝細胞死亡的機制

WIRI中肝細胞死亡主要機制是細胞凋亡和腫脹壞死[28]。凋亡細胞的標志包括染色質凝聚和核碎裂、細胞皺縮及凋亡小體形成。而壞死細胞的特征是細胞膜的完整性和細胞結構的破壞、空泡化和線粒體腫脹。目前對于WIRI中肝細胞主要死亡形式存有爭論[29]，但細胞壞死是一種能量依賴的過程，理論上當ATP耗竭較大時，壞死應該占主導地位。

WIRI經由許多不同的途徑引起細胞死亡，主要包括：(1)線粒體功能障礙：在線粒體內膜的非選擇性通透性轉換孔改變導致氧化磷酸化解耦聯，引起膜去極化，導致細胞凋亡或壞死。(2)細胞內ATP水平降低：肝細胞缺血缺氧可刺激線粒體通透性轉換(mitochondrial permeability transition，MPT)，線粒體膜電位崩塌，導致ATP合成失敗，釋放細胞色素C(cytochrome C，Cyt-C)和凋亡誘導因子等。(3)活性氧機制：損傷的線粒體逐漸產生大量的ROS，同時ROS逐漸增多也可損壞同一線粒體，從而使ATP產生減少和細胞功能損害的可能性增大。除了高ROS產生系統，肝臟中抗氧化劑(如谷胱甘肽)和超氧化物歧化酶呈現低水平狀態，進一步加劇ROS產生的有害影響。(4)細胞內鈣超載機制：細胞內鈣水平受缺血狀態影響，細胞內鈣離子增加可導致細胞凋亡。ATP迅速耗竭，細胞內鈣水平增加，在肝細胞線粒體通透性轉換孔中激活許多蛋白激酶，也可以激活線粒體外的信號加劇壞死途徑。(5)凋亡基因作用：MPT使線粒體破裂，釋放許多促凋亡蛋白進入細胞質，誘導Cyt-C和凋亡誘導因子，快速啟動細胞凋亡級聯。此外，再灌注期間TNF-α、IL-6和其他介質也可激活許多蛋白質，如蛋白酶半胱氨酸天冬氨酸(caspase)-3和caspase-8以及線粒體Cyt-C等釋放到細胞質中，參與肝細胞凋亡。Ye等[30]應用不同劑量富含甲烷的鹽水處理大鼠熱缺血再灌注模型，結果顯示甲烷的抗凋亡、抗炎及抗氧化作用可減弱WIRI。

3 IR影響WIRI中肝細胞再生的機制

通常情況下，肝細胞保持一個階段的沉寂(被稱為G0期)，在適當的刺激時具有獨特的增殖能力。肝臟再生的分子基礎由啟動階段、增殖階段和終止階段3個階段組成。這些階段的發生涉及生長因子、細胞因子和其他介質高度協調和同步模式的相互作用[31]。生長因子如IL-6、TNF-α、表皮生長因子和肝細胞生長因子，轉錄因子如信號轉導子和轉錄激活子-3、轉錄因子活化蛋白-1和核轉錄因子-κB，立即早期基因如原癌基因(c-fos、c-myc)和細胞周期蛋白，均是WIRI中肝細胞修復和再生的標志物。WIRI引起細胞因子、轉錄因子和立即早期基因上調增強，導致更為顯著的肝細胞復制反應[32]。根據損傷的嚴重程度，WIRI對肝細胞再生的影響有兩個方面：(1)一定程度的損傷可刺激肝再生的標志物，啟動肝再生級聯活動途徑，增強肝細胞再生能力，促進損傷后肝組織的修復；(2)損傷程度較大、余肝體積較小、余肝質量較差，均可引起余肝再生能力下降，抑制損傷后肝組織的修復。Kato等[33]的實驗研究表明，基質金屬蛋白酶-9活性通過血小板內皮細胞黏附分子-1依賴性機制破壞血管完整性，并妨礙肝再生。

4 小 結

肝細胞WIRI是器官移植和其他臨床疾病中涉及多因素、多途徑相互作用的多方面且復雜的病理生理過程。近年來，研究者對WIRI引起肝細胞損傷的發生機制的認識顯著提高，也提出了許多的潛在治療方案，并在采用外科手術干預、缺血前后預處理、藥物制劑和基因治療等手段來預防和減少肝細胞WIRI等方面取得一定成果，但在臨床應用上仍然存在一些缺陷和問題。因此，應采用新的方法進一步研究肝細胞WIRI的發生機制及基因組特征，為臨床制定有效的預防和治療策略提供依據，是下一步研究的內容和方向。

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廣西研究生教育創新計劃項目(YCSZ2015225)

李文川(1991～)，男，碩士研究生，研究方向：普通外科腫瘤病因與基礎研究。

浦澗(1965～)，男，博士，教授，研究方向：普通外科腫瘤病因與基礎研究，E-mail：pujianym@163.com。

R 657.3

A

0253-4304(2016)02-0233-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.02.25

2015-10-02

2016-01-08)