白藜蘆醇對難治性癲癇細胞模型神經元損傷及神經突起的影響

劉秀穎 吳 原 藍瑞芳

(1 廣西欽州市第一人民醫院神經內科，欽州市 535000，E-mail：13471716560@163.com；2 廣西醫科大學第一附屬醫院神經內科，南寧市 530021)

白藜蘆醇對難治性癲癇細胞模型神經元損傷及神經突起的影響

劉秀穎1吳 原2藍瑞芳1

(1 廣西欽州市第一人民醫院神經內科，欽州市 535000，E-mail：13471716560@163.com；2 廣西醫科大學第一附屬醫院神經內科，南寧市 530021)

目的 探討白藜蘆醇(Res)對難治性癲癇細胞模型的神經元損傷及神經突起形態學變化的影響。方法 將體外培養至第10天的大鼠乳鼠海馬神經元分為對照組、模型組、10 μmol/L Res組、20 μmol/L Res組、40 μmol/L Res組及60 μmol/L Res組。對照組采用正常細胞的細胞外液培養3 h后恢復維持培養液，模型組采用無鎂細胞外液培養3 h后恢復維持培養液，4個 Res組經無鎂細胞外液培養3 h后加入相應濃度的Res培養液。檢測建立模型后24 h各組細胞上清液乳酸脫氫酶(LDH)的活性，光學顯微鏡下觀察各組神經元及神經突起的形態學變化。結果 與對照組相比，模型組及各濃度Res組的LDH活性顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L Res組LDH活性明顯降低(P<0.05)，其中以40 μmol/L Res組最低；60 μmol /L Res組與模型細胞的LDH活性比較，差異無統計學意義(P>0.05)。經建立模型后24 h，光學顯微鏡下可見模型組神經突起之間相互遷移聚集，突起連接成“網格樣”；40 μmol/L Res組出現少部分神經突起遷移靠近聚集，大部分的突起連接分布均勻。結論 Res能減少難治性癲癇細胞模型的神經元損傷，抑制異常神經突起連接的形成。

難治性癲癇；白黎蘆醇；神經元；神經突起；細胞模型；大鼠

癲癇經藥物治療后可獲長期緩解，但仍有20%～30%的患者不能得到有效控制，發展為難治性癲癇，即耐藥性癲癇。難治性癲癇患者的癲癇癥狀長期反復發作，不僅使患者軀體受到損害，而且在一定程度上導致患者心理障礙及一系列的社會問題。白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種天然多酚類，廣泛存在于葡萄皮、虎杖等植物中。目前已有實驗研究發現，Res有抗癲癇的作用及對癲癇發作后損傷的神經元有保護作用[1]，但由于其抗癲癇的機制仍未完全明確而制約了臨床應用。本實驗擬通過無鎂液建立體外難治性癲癇細胞模型，觀察Res對難治性癲癇細胞模型神經元損傷及神經突起形態學變化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 Res(純度99%，批號PCS0043)購自北京中科儀友化工技術研究院。

1.2 實驗動物 新生24 h內SD大鼠乳鼠12只，無特定病原體級，體重5～12 g，雌雄不限，購于廣西醫科大學實驗中心，許可證號： SCXK(桂)2010-0002。

1.3 主要試劑 胎牛血清(Hyclone公司)、神經元基礎培養基(Gibco公司)、胰蛋白酶(Sigma公司)、L-多聚賴氨酸 (Sigma公司)、B-27添加劑(Gibco公司)、神經微絲(Sigma公司)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)試劑盒(上海執誠)。主要溶液的配制：(1)種植培養液：90%的神經元基礎培養基、10%胎牛血清、0.2 mol/L的L-谷氨酰胺、100 U/ml的青霉素及100 mg/L的鏈霉素。(2)維持培養液：98%的神經元基礎培養基、2% B-27添加劑、0.2 mol/L的L-谷氨酰胺、100 U/ml的青霉素及100 mg/L的鏈霉素。(3)無鎂細胞外液的配制：145 mmol/L氯化鈉、2.5 mmol/L氯化鉀、10 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸、2 mmol/L氯化鈣、10 mmol/L葡萄糖、0.002 mmol/L甘氨酸，將上述重量的粉末溶于1 000 ml的三蒸水，用NaOH將pH調至7.2，過濾滅菌后置于4℃冰箱待用。無鎂細胞外液不含氯化鎂成分，其余成分與細胞外液成分相同。

1.4 儀器設備 CO2培養箱(美國Thermo Forma公司)，Zeiss Axiovert 200倒置相差熒光顯微鏡(德國Olympus公司)，SW-CJ-1F凈化工作臺(蘇州凈化集團安泰公司)。

1.5 方法

1.5.1 海馬神經元的培養：實驗前一晚將小蓋玻片置于用培養基濕潤過的12孔培養板，每個玻片小心滴加0.5 ml的多聚賴氨酸溶液，置于37℃、5% CO2培養箱過夜，用三蒸水清洗3遍后晾干備用。取SD大鼠，斷頭取腦，將大腦投入裝有D-Hanks液的培養皿中(培養皿底下墊冰)，暴露雙側海馬，鈍性分離海馬，置于另一個裝有D-Hanks液的培養皿中(培養皿底下墊冰)，將海馬組織剪碎為1 mm×1 mm×1 mm的小塊。將剪碎的組織移入含有相當于5倍腦組織體積的0.125%濃度胰酶的離心管中，在37℃水浴箱中作用20～25 min，加入4 ml種植培養液終止消化，吸管輕輕吹打細胞約30次，1 000 r/min離心5 min，棄上清，在沉淀中再加適量種植培養液后，用吸管輕輕吹打成單細胞懸液，臺盼藍染色，血細胞計數板計數活細胞，根據計數結果，調整細胞終濃度為(1～2)×105個/ml，以此濃度接種于預先包被過的12孔培養板中，置于培養箱中培養。種板后10 h將培養液全量換成維持培養液，隨后每3 d半量換液。

1.5.2 神經元的鑒定：采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(streptavidin-perosidase，SP)免疫細胞化學染色，以神經微絲蛋白單克隆抗體標記神經元。

1.5.3 神經元分組及難治性癲癇細胞模型的建立：將培養至第10天的海馬神經元分為對照組、模型組及4個濃度的Res組，每組設6個平行孔。對照組更換為正常細胞的細胞外液培養3 h后恢復維持培養液。模型組為更換為無鎂細胞外液培養3 h后恢復維持培養液，4個濃度的Res組經無鎂細胞外液培養3 h后在每孔加入最終濃度為10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L 的Res培養液，繼續培養24 h。

1.5.4 分別取上述各組細胞建立模型24 h后的細胞培養液20 μl，按照LDH盒的說明，于全自動生化分析儀上測定LDH。

1.5.5 觀察神經突起連接的形態學變化：倒置相差熒光顯微鏡下觀察各組神經元及神經突起的變化。

1.6 統計學分析 應用SPSS 13.0軟件進行統計學分析，計量資料以(x±s)表示，多組均數比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 神經元鑒定 利用神經微絲蛋白抗體鑒定，倒置顯微鏡下可見神經元胞漿內和軸突內棕黃色陽性顆粒，視野中可見大部分為神經元細胞，偶見非神經元細胞，表明所采用得培養方法獲得的海馬神經元純度相對較高。見圖1。

2.2 各組LDH活性的比較 與對照組相比，模型組及各濃度Res組的LDH活性顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，10 μmol/L Res組、20 μmol/L Res組、40 μmol/L Res組LDH的活性均有所減少(P<0.05)，其中40 μmol/L組達到最低；60 μmol/L組與模型組間LDH活性比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組的LDH活性比較(x±s，U/L)

注：與對照組比較，※P<0.05；與模型組比較，★P<0.05。

2.3 各組神經突起連接的形態學 模型組未經無鎂液處理前，神經元光暈明顯，神經元突起豐滿，神經突起連接分布有序、均勻，見圖2；無鎂細胞外液處理3 h后，神經元形態及神經網絡光鏡下均未見明顯變化；造模24 h后可見神經元胞體之間相互靠近，神經突起之間相互遷移聚集，突起連接成“網格樣”變化，見圖3。各Res濃度組細胞生長狀態較模型組好，神經元突起仍大多豐滿，僅出現少部分神經突起遷移靠近聚集，大部分的突起連接分布均勻，其中以40 μmol/L Res組最明顯，見圖4。對照組與無鎂細胞外液處理前的模型組比較，細胞生長狀態無明顯變化。

圖1 SD大鼠的海馬神經元神經微絲蛋白免疫化學染色(×200)圖2 無鎂細胞外液處理前模型組的神經元突起及神經突起連接鏡下情況(×200)圖3 造模24h后模型組神經突起及神經突起連接的鏡下情況(×200)圖4 造模24h后40μmol/LRes組神經突起及神經突起連接的鏡下情況(×200)

3 討 論

通過體外培養海馬神經元細胞，無鎂液作用3 h后，可成為自發穩定放電癲癇細胞模型，該模型可作為難治性癲癇的細胞模型，已得到了很多研究者的認可[2-4]，目前廣泛應用于抗癲癇新藥的實驗研究中[5-6]。Res存在于多種植物中，具有抗氧化、清除氧自由基、抗癲癇等多種生理活性。尤竹燕等[7]發現Res能抑制大鼠海馬CA1區誘發癲癇樣放電活動。有研究表明發現Res通過上調癲癇動物模型大鼠內海馬內源性抗氧化酶，調控凋亡相關蛋白的表達，對抗癲癇發作發生的氧化損傷從而發揮神經保護作用[8]。但Res對難治性癲癇細胞模型的影響未見有報告。

LDH是廣泛存在于神經元及神經膠質細胞中的氧化還原酶，正常情況下釋放很少，細胞一旦受損，LDH即被釋放到細胞外，且其水平與損傷程度呈正相關，可敏感反映細胞的活性。因此，通過測定LDH的量可以定量衡量細胞的損傷程度[9]。以往Res體內實驗(包括了抗癲癇及缺血再灌注損傷模型)的給藥范圍為10～60 μmol/L[10-11]，本實驗在此基礎上，選擇了10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L 4個劑量進行研究。結果顯示，與對照組相比，模型組及各濃度Res組的LDH活性顯著增加(P<0.05)，提示難治性癲癇模型大鼠的神經元損傷；與模型組相比，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L Res組的LDH活性均有所減少(P<0.05)，其中40 μmol/L Res組最低，表明Res能減輕難治性癲癇細胞模型神經元損傷，從病理生理學角度證明了Res對難治性癲癇細胞模型有確切的保護作用，其中以40 μmol/L Res組保護作用最強，提示Res的作用有一定的濃度依賴關系。但60 μmol/L Res組與模型組之間比較無顯著性差異(P>0.05)，提示60 μmol/L的Res對難治性癲癇模型的細胞活性無明顯影響，因此對于Res有效的藥物濃度仍有待于進一步細致的研究。

難治性癲癇的發生機制與很多因素有關，目前神經網絡學說正受到普遍關注，研究已證實反復的癲癇發作可導致腦組織尤其是海馬結構的損傷，引起齒狀回苔蘚纖維側枝發芽形成新的突觸聯系，最終形成異常的神經網絡在難治性癲癇發病中有著重要意義[12-13]，促進了難治性癲癇的形成和反復發作。有動物模型研究發現，Res是通過抑制苔蘚纖維發芽從而減少癇樣放電的頻率發揮抗癲癇的作用[14]。在本實驗中，我們同樣觀察到了難治性癲癇細胞模型中存在神經突起連接的變化，表現為神經突起相互遷移聚集，突起連接成“網格樣”變化，而Res干預組僅出現少部分神經突起遷移聚集，大部分的突起連接分布均勻。由此我們推測Res對難治性癲癇細胞模型異常網絡的形成有一定抑制作用。

綜上所述，Res能減少難治性癲癇細胞模型的神經元損傷，抑制異常神經突起連接的形成。

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Effects of resveratrol on neuronal damage and neurite in cell model of intractable epilepsy

LIUXiu-ying1,WUYuan2,LANRui-fang1

(1DepartmentofNeurology,theFirstPeople′sHospitalofQinzhouCity,Qinzhou535000,China; 2DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To explore the effects of resveratrol(Res) on the neuronal damage and morphologic change of neurite in cell model of intractable epilepsy.Methods On the 10th day of culture in vitro,the hippocampal neurons of neonatal rats were divided into control group,model group,10 μmol/L Res group,20 μmol/L Res group,40 μmol/L Res group and 60 μmol/L Res group.Control group and model group continued to be cultured with feeding medium after 3 hours of culturing with normal extracellular fluid and magnesium-free extracellular fluid respectively.Res culture medium with corresponding concentrations was added to the four Res groups after 3 hours of culturing with magnesium-free extracellular fluid.After 24 hours of modeling,the lactic dehydrogenase(LDH) activity of cell supernatant was detected in all groups,and the morphologic changes of neuron and neurite were observed in each group with optical microscope.Results Compared to control group,model group and four Res groups had significantly increased activities of LDH(P<0.05).The activities of LDH in 10 μmol/L Res group,20 μmol/L Res group and 40 μmol/L Res group decreased significantly compared to that in the model group(P<0.05),and the lowest activity was observed in 40 μmol/L Res group.But there was no statistical difference in the activity of LDH between 60 μmol/L Res group and model group(P>0.05).After 24 hours of modeling,the observation under optical microscope showed that neurites migrated closely to each other and connected to be grid-shaped in the model group,but a few neurites migrated closely to each other and most of neurites connections uniformly distributed in 40μmol/L Res group.Conclusion Res can reduce the neuronal damage in the cell model of intractable epilepsy,and can inhibit the formation of abnormal neurite connections.

Intractable epilepsy,Resveratrol,Neuron,Neurite,Cell model,Rat

劉秀穎(1983～)，女，碩士，主治醫師，研究方向：癲癇。

R 74

A

0253-4304(2016)02-0164-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.02.05

2015-11-24

2016-01-25)