蜂毒明肽對重癥急性胰腺炎合并腎損傷大鼠腎功能的保護作用

劉珊珊 袁玉林

(武漢大學基礎醫學院，武漢市 430071，E-mail：liushanshan0729@sina.com)

蜂毒明肽對重癥急性胰腺炎合并腎損傷大鼠腎功能的保護作用

劉珊珊 袁玉林

(武漢大學基礎醫學院，武漢市 430071，E-mail：liushanshan0729@sina.com)

目的 探討蜂毒明肽對重癥急性胰腺炎(SAP)合并腎損傷大鼠腎功能的影響。方法 將32只SD大鼠分為假手術組(SO組)、SAP組、蜂毒明肽組(Apamin組)、溶劑對照組(DMSO組)各8只。采用膽胰管逆行注射牛黃膽酸鈉構建重癥急性胰腺炎大鼠模型，其中并對Apamin組大鼠應用蜂毒明肽進行干預，測定術后12 h各組大鼠的血清淀粉酶，脂肪酶及血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1(IL-1)及白細胞介素-6(IL-6)水平，并觀察大鼠胰腺及腎臟病理改變。結果 Apamin組及SAP組的淀粉酶、Scr、BUN、TNF-α、IL-1、IL-6水平以及胰腺及腎臟病理評分均高于SO組(P<0.05)，Apamin組的以上指標均低于SAP(P<0.05)。結論 蜂毒明肽能夠減輕SAP所致的炎癥反應進而緩解其引發的腎損傷。

重癥急性胰腺炎；蜂毒明肽；腎損傷；腎功能；淀粉酶；脂肪酶；大鼠

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是消化系統常見的急腹癥之一，其病情發展迅速、病死率高，且極易引發胰腺外臟器衰竭進而發展為多器官功能衰竭，導致病死率明顯升高[1]。急性腎損傷是SAP所致胰腺外臟器損傷較為常見的并發癥，SAP并發急性腎損傷會使疾病轉歸發生重大改變，患者病死率明顯增高，因此，在SAP發生的早期對可能出現的腎損傷進行積極預防及治療，對疾病的轉歸具有重要臨床意義。蜂毒是由蜜蜂體內提取出的自然毒素，有研究證實其具有抗關節炎、緩解水腫性炎癥引發的疼痛等作用[2-3]。蜂毒的化學成分復雜，其主要由蜂毒肽、蜂毒明肽構成。有研究表明蜂毒肽具有抑制核因子-κB的作用[4]。本實驗旨在探討蜂毒明肽的抑制炎性因子進而保護腎功能的效果，以及減輕SAP所致腎損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型的制備 無特定病原體級雄性SD大鼠32只(北京華阜康公司，質量合格證號：11401300011894)，體重為180～200 g，采用隨機數表法分為假手術組(sham-operation，SO組)、SAP組、蜂毒明肽組(Apamin組)、溶劑對照組[二甲基亞砜組(dimethyl sulfoxide，DMSO組)]，每組8只大鼠。實驗前8 h予禁食、不禁水。麻醉采用10%水合氯醛(0.3 ml/kg)腹腔注射。在SAP組及Apamin組建立SAP大鼠模型：予腹部消毒，于劍突下正中切口進入腹腔，尋找膽胰管在十二指腸的開口處，逆行插管，5%的牛黃膽酸鈉(1 ml/kg)以1 ml/min勻速注入膽胰管，成功制備SAP模型，術后大鼠皮下給予5 ml生理鹽水補液。SO組麻醉后僅打開腹腔并翻動十二指腸，另無其他處理。各組均術后補液處理。參照文獻[5]的方法，Apamin組在制備SAP模型完成后30 min及6 h皮下注射Apamin(購于Sigma公司；Apamin溶于DMSO后注射)，劑量100 μg/kg。DMSO組給予皮下注射0.5% DMSO(Sigma公司，D2650)，劑量0.2 ml/100 g。SAP組術后僅給予補液，無其他特殊給藥。

1.2 血清酶學指標及標本 術后12 h行血清酶學、炎癥因子檢測，以及胰腺、腎臟組織標本取材。大鼠麻醉后于下腔靜脈取血，4℃、轉速1 300 r/min離心5 min后取上層血清，-20℃保存備用。(1)采用西門子全自動生化檢測儀測定血清淀粉酶、脂肪酶、血肌酐(serum creatinine，Scr)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)，由武漢大學人民醫院檢驗科協助完成。(2)根據酶聯免疫吸附試驗試劑盒(武漢華美生物公司)說明書的操作步驟，取血清檢測血清腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)水平。(3)取胰腺組織及大鼠右腎上極，4%多聚甲醛固定，包埋、切成3 μm厚切片，用蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，顯微鏡下觀察胰腺及形態改變，由兩名病理醫師根據文獻[6]中的標準進行胰腺病理學評分，根據文獻[7]中的標準進行腎臟病理評分。

1.3 統計學分析 應用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，符合正態分布和方差齊的計量資料采用(x±s)表示，多組間數據比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組術后12 h血清胰腺酶學指標的比較 4組間淀粉酶、脂肪酶水平的比較，差異有統計學意義(P<0.05)。其中，SAP組及Apamin組的血清淀粉酶及脂肪酶均較SO組明顯升高(P<0.05)；Apamin組淀粉酶水平低于SAP組(P<0.05)，脂肪酶水平低于SAP組，但差異無統計學意義(P>0.05)。DMSO組與SO組的血清淀粉酶及脂肪酶比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組術后12 h血清胰腺酶學指標的比較(x±s，U/L)

注：與SO組比較，*P<0.05；與SAP組比較，#P<0.05。

2.2 各組術后12 h胰腺、腎臟病理學改變及病理評分 (1)病理學改變：SO組胰腺形態完整，無水腫、出血及相關病理改變；SAP組可見胰腺腺泡細胞大量壞死，內有出血水腫；Apamin組可見胰腺腺泡細胞較SAP組壞死減少，仍有出血水腫；DMSO組僅見胰腺輕度水腫。見圖1。SO組腎臟無病理學改變，腎小管上皮細胞無出血、水腫及炎癥細胞浸潤；SAP組可見腎小管間質內出血，腎小管上皮細胞脫落并管型形成；Apamin組可見出血減少，腎小管上皮細胞脫落并管型形成較SAP減輕；DMSO組與SO組相似，均無明顯改變，見圖2。(2)病理評分：術后12h，SAP組及Apamin組的胰腺及病理評分均明顯高于SO組(P<0.05)；經過蜂毒明肽治療后Apamin組胰腺及腎臟病理評分低于SAP組(P<0.05)。見表2。

A SO組胰腺形態學改變 B SAP組胰腺形態學改變 C Apamin組胰腺形態學改變 D DMSO組胰腺形態學改變

圖1 各組術后12 h胰腺病理學改變(HE染色，×200)

A SO組腎臟形態學改變 B SAP組腎臟形態學改變 C Apamin組腎臟形態學改變 D DMSO組腎臟形態學改變

圖2 各組術后12 h腎臟病理學改變(HE染色，×200)

注：與SO組比較，*P<0.05；與SAP組比較，#P<0.05。

2.3 各組術后12 h TNF-α、IL-1、IL-6、BUN及Scr水平比較 4組間TNF-α、IL-1、IL-6、BUN及Scr水平比較，差異有統計意義(P<0.05)。SAP組及Apamin組的TNF-α、IL-1、IL-6、BUN及Scr水平均明顯高于SO組(P<0.05)，Apamin組的各項指標均低于SAP組(P<0.05)，但DMOS組的各項指標與SO組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組術后12 h TNF-α、IL-1、IL-6、BUN及Scr水平比較(x±s)

注：與SO組比較，*P<0.05；與SAP組比較，#P<0.05。

3 討 論

SAP是目前消化系統疾病中較為嚴重的綜合性疾病，當急性胰腺炎進展為SAP時，嚴重的全身炎癥反應可釋放大量炎癥因子導致胰腺腺泡細胞壞死，并進一步導致胰外器官功能損害，嚴重者可發生多器官功能衰竭。目前繼發于SAP的急性腎損傷是僅次于肺損傷的一種嚴重胰腺外臟器損傷。若急性腎損傷發展為急性腎衰竭，患者的死亡率達80%左右[8]，因此在SAP發生時應該預防性地保護患者腎功能，這對治療SAP具有重要的意義。

本研究通過膽胰管逆行注射牛黃膽酸鈉構建SAP大鼠模型，探討蜂毒明肽在SAP腎損傷中的保護作用，實驗中采用DMSO作為Apamin溶劑，但DMOS組的血清淀粉酶、脂肪酶、腎功能等指標與SO組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，且胰腺、腎臟無明顯病理改變，提示DMSO對正常大鼠影響不大。建模成功后SAP組及Apamin組大鼠的血清淀粉酶、脂肪酶均較SO組明顯升高(P<0.05)，而TNF-α，IL-1、IL-6、BUN及Scr水平也明顯高于SO組(P<0.05)。此外SAP組及Apamin組的胰腺及腎臟病理評分均高于明顯高于SO組(P<0.05)，提示大鼠發生SAP后血液中炎性因子水平升高并存在急性腎功能損傷。而與SAP組相比，Apamin組的血清淀粉酶、TNF-α，IL-1、IL-6、BUN及Scr水平均明顯下降(P<0.05)。鏡下病理結果顯示Apamin組胰腺、腎臟的損傷較SAP組減輕，胰腺、腎臟病理評分亦較SAP組降低(P<0.05)，提示應用蜂毒明肽治療后能夠明顯降低大鼠的炎癥因子水平并改善胰腺及腎臟病理評分，這表明蜂毒明肽可通過抑制機體的炎癥反應進一步減輕胰腺及腎損傷。其可能的機制為蜂毒明肽通過抑制炎癥細胞浸潤以起到抗炎作用。TNF-α、IL-1及IL-6等炎癥因子在發生炎癥時候能夠產生一系列連鎖反應及放大效應，會進一步導致全身炎性反應及多器官功能衰竭。近年來研究顯示，蜂毒在炎癥發生過程及進展中具有明顯的負向調節作用，從而能在多種炎癥反應綜合征中保護相關器官[4]。已有研究表明蜂毒明肽可在骨關節、心血管及呼吸系統等諸多器官的急、慢性炎性疾病及全身炎癥反應綜合征中發揮一定的作用，包括緩解炎癥反應、減輕組織形態損傷、保護臟器功能等[9]。

綜上所述，蜂毒明肽作為蜂毒中主要化學成分之一，在大鼠發生SAP時對腎功能具有保護作用，其機制可能與抑制炎癥因子的浸潤有關。

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Protective effect of apamin on renal function in rats with severe acute pancreatitis combined with renal injury

LIUShan-shan,YUANYu-lin

(SchoolofBasicMedicalSciences,WuhanUniversity,Wuhan430071,China)

Objective To explore the effect of apamin on the renal function in rats with severe acute pancreatitis(SAP) combined with renal injury.Methods Thirty-two SD rats were divided into sham-operation group(SO group),SAP group,apamin group(Apamin group) and solvent-control group(DMSO group),with 8 rats for each group.Retrograde cholangiopancreatic duct injection with sodium taurocholate was used to establish the rat models of severe acute pancreatitis.And the rats in the Apamin group were intervened with apamin.At 12 hours after operation,the levels of serum amylase,lipase,serum creatinine(Scr),blood urea nitrogen(BUN),tumor necrosis factor-α(TNF-α),interleukin-1β(IL-1β ) and interleukin-6(IL-6) were detected in all groups.Pancreas and renal histopathological changes of the rats were observed.Results Compared to OS group,Apamin group and SAP group had higer levels of amylase,Scr,BUN,TNF-α,IL-1β,IL-6,pancreas and renal histopathological scores(P<0.05).And these indices of Apamin group were lower than those of SAP group(P<0.05).Conclusion Apamin may alleviate renal injury by reducing SAP-induced inflammatory responses.

Severe acute pancreatitis,Apamin,Renal injury,Renal function,Amylase,Lipase,Rat

劉珊珊(1980～)，女，碩士，主治醫師，研究方向：消化系統疾病的診治。

袁玉林(1967～)，女，博士，教授，研究方向：消化系統疾病的診治，E-mail：yuanyulin19620120@126.com。

R 576.1

A

0253-4304(2016)02-0157-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.02.03

2015-07-29

2015-10-23)