D-葡萄糖同系物作為人類肝癌細胞BEL-7402熒光探針的價值▲

呂 良 唐煥煥 陽艷麗 苑 博 陳夢青 陳高建 張可鋒盧 曦 鐘明利 徐 慶 韋京辰 羅 艷 韋桂嬌 蔣璐慧 段小群

(桂林醫學院1 藥學院，2 生物技術學院，桂林市 541004，E-mail：luliang998@163.com)

論著·基礎研究

D-葡萄糖同系物作為人類肝癌細胞BEL-7402熒光探針的價值▲

呂 良1唐煥煥1陽艷麗1苑 博1陳夢青1陳高建1張可鋒1盧 曦2鐘明利1徐 慶1韋京辰1羅 艷1韋桂嬌1蔣璐慧1段小群1

(桂林醫學院1 藥學院，2 生物技術學院，桂林市 541004，E-mail：luliang998@163.com)

目的 評價熒光D-葡萄糖同系物2-NBDG作為肝癌細胞BEL-7402熒光探針的價值。方法 肝癌細胞株BEL-7402培養24 h后分為實驗組及對照組，其中實驗組加入5 mmol/L D-葡萄糖的DMEM培養基，對照組加入不含5 mmol/L D-葡萄糖的DMEM培養基，再將兩組各分為兩個亞組加入不同濃度的2-NBDG(0.3 mmol/L、1 mmol/L)，即共4組：0.3 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-葡萄糖組、1 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-葡萄糖組、0.3 mmol/L 2-NBDG組、1 mmol/L 2-NBDG組。比較各組細胞熒光強度，分析2-NBDG在肝癌細胞BEL-7402中的攝取及熒光成像情況，以及D-葡萄糖對2-NBDG的抑制競爭作用。結果 0.3 mmol/L 2-NBDG組的相對熒光強度為(78.72±3.78)%，低于1 mmol/L 2-NBDG組的(100.00±8.23)%(P<0.05)。0.3 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-葡萄糖組的相對熒光強度為(20.67±1.46)%，明顯低于0.3 mmol/L 2-NBDG組的(78.72±3.78)%(P<0.05)。1 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-葡萄糖組的相對熒光強度為(22.23±2.01)%，明顯低于1 mmol/L 2-NBDG組的(100.00±8.23)%(P<0.05)。結論 2-NBDG可被肝癌細胞BEL-7402快速攝取，并可通過熒光強度的方式量化其攝取程度，D-葡萄糖可競爭性抑制肝癌細胞BEL-7402對2-NBDG攝取。2-NBDG可以作為人源肝癌細胞株BEL-7402的檢測熒光探針。

肝癌；肝癌細胞BEL-7402；D-葡萄糖同系物；熒光探針；糖攝取；診斷

目前，原發性肝癌是臨床上最常見的腫瘤之一，發病率居惡性腫瘤的第5位，死亡率居全球第3位[1]。肝癌發病早期缺乏特征性癥狀，與多數消化道疾病的癥狀相似，因此很難在發病早期進行確診[2]。傳統惡性腫瘤的診斷是基于組織形態學的異常變化，通過CT、磁共振成像、超聲檢查等技術去辨認[3-4]。然而，對于惡性腫瘤細胞，其內部異常代謝的發生會早于外部形態的變化，其中細胞的糖酵解加速即是典型表現[5]。與此同時，惡性腫瘤細胞對葡萄糖的攝取也會相應地增多。因此，相關學者利用這一現象尋求更為靈敏的靶向檢查腫瘤組織的新方法，如放射核素標記的葡萄糖同系物在腫瘤細胞中的快速攝取[4-6]。但利用放射核素標記技術有諸多缺點，如放射性核素垃圾難以處理和消除、不能直接檢測單一的活細胞等[7]。熒光D-葡萄糖同系物{2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1，3-diazol-4-yl)amino]-2-deoxy-D-glucose，2-NBDG}易于通過熒光顯微鏡觀察，而不會帶來放射風險[8]。本研究采用肝癌細胞BEL-7402為研究對象，評價2-NBDG在肝癌細胞中的攝取情況以及作為肝癌細胞BEL-7402熒光探針的價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器 肝癌細胞BEL-7402(購自中山大學實驗動物中心)，DMEM普通培養基(Gibco公司)，胎牛血清(Gibco公司)，2-NBDG(Invitrogen公司)，D-葡萄糖(天津科密歐化學試劑公司)，胰酶細胞消化液(碧云天公司)，熒光顯微鏡(萊卡DM2000)。

1.2 方法

1.2.1 BEL-7402細胞培養：用DMEM高糖培養基+10%胎牛血清+100 U/ml青霉素+100 μg/ml鏈霉素培養細胞，細胞每隔3～5 d按1 ∶5比例進行傳代。1.2.2 實驗方法：將BEL-7402細胞進行計數，以每孔1×104的細胞數種在48孔板中。培養24 h后，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗3次后分為實驗組及對照組，其中實驗組加入含5 mmol/L D-葡萄糖的DMEM培養基，對照組加入不含5 mmol/L D-葡萄糖的DMEM培養基，再將兩組各分為兩個亞組加入不同濃度的2-NBDG(0.3 mmol/L、1 mmol/L)，即共4組：0.3 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-葡萄糖組、1 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-葡萄糖組、0.3 mmol/L 2-NBDG組、1 mmol/L 2-NBDG組。4組BEL-7402細胞均在37℃下孵育20 min，再用PBS洗3次后在熒光顯微鏡下觀察并攝像。實驗重復3次。 利用IPP6.0軟件計算各組細胞熒光強度。 1.3 統計學分析 應用 SPSS 20.0軟件進行統計學分析，計量資料以(x±s)表示，比較均采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組細胞攝入2-NBDG情況 2-NBDG孵育20 min后，在未加入D-葡萄糖的情況下，1 mmol/L 2-NBDG組細胞熒光強度大于0.3 mmol/L 2-NBDG組(圖1 a-2及c-2)，即細胞熒光強度呈劑量依賴性增加。在0.3 mmol/L 2-NBDG組中，與未加入D-葡萄糖組比較，加入D-葡萄糖后，細胞熒光強度呈顯著性減弱(圖1 a-2及b-2)。在1 mmol/L 2-NBDG組中，與未加入D-葡萄糖組比較，加入D-葡萄糖后，細胞熒光強度顯著性減弱(圖1 c-2及d-2)。見圖1。

圖1 2-NBDG標記后BEL-7402細胞光學成像(200×)

a和b為加入0.3 mmol/L 2-NBDG的BEL-7402細胞，其中a-1為正常培養條件下的細胞白光圖片，a-2為細胞熒光圖片，b-1為添加5 mmol/L D-葡萄糖下的細胞白光圖片，b-2為添加5 mmol/L D-葡萄糖的細胞熒光圖片；c和d為加入1 mmol/L 2-NBDG的BEL-7402細胞，其中c-1為正常培養條件下的細胞白光圖片，c-2為細胞熒光圖片，d-1為添加5 mmol/L D-葡萄糖的細胞白光圖片，d-2為添加5 mmol/L D-葡萄糖的細胞熒光圖片。

2.2 不同2-NBDG濃度組BEL-7402細胞的相對熒光強度 2-NBDG孵育20 min后，以1 mmol/L 2-NBDG組為100%的相對熒光強度，0.3 mmol/L 2-NBDG組的相對熒光強度為(78.72±3.78)%，低于1 mmol/L 2-NBDG組的(100.00±8.23)%(t=4.000，P=0.011)。

2.3 5 mmol/L D-葡萄糖對BEL-7402細胞攝取0.3 mmol/L 2-NBDG的影響 0.3 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-葡萄糖組的相對熒光強度為(20.67±1.46)%，明顯低于0.3 mmol/L 2-NBDG組的(78.72±3.78)%(t=31.866，P=0.001)。

2.4 5 mmol/L D-葡萄糖對BEL-7402細胞攝取1 mmol/L 2-NBDG的影響 1 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-葡萄糖組的相對熒光強度為(22.23±2.01)%，明顯低于1 mmol/L 2-NBDG組的(100.00±8.23)%(t=17.326，P=0.001)。

3 討 論

本研究結果顯示，0.3 mmol/L 2-NBDG組及1 mmol/L 2-NBDG組的相對熒光強度分別為(78.72±3.78)%、(100.00±8.23)%，這表明肝癌細胞BEL-7402可以快速攝取2-NBDG，并且2-NBDG在該細胞上具有激發熒光的作用，其進入細胞內部后表現為聚集狀態，這是己糖激酶將其6位C磷酸化的結果[9]，這也易于觀察2-NBDG。而0.3 mmol/L 2-NBDG組的相對熒光強度低于1 mmol/L 2-NBDG組(P<0.05)，提示在2-NBDG一定劑量范圍內，這種熒光強度與劑量(攝取量)成正比。此外，加入5 mmol/L D-葡萄糖后，0.3 mmol/L 2-NBDG及1 mmol/L 2-NBDG中BEL-7402細胞的相對熒光強度均明顯降低(P<0.05)，這表明D-葡萄糖可影響肝癌細胞BEL-7402對2-NBDG的攝取，呈競爭性抑制熒光強度的作用。

2-NBDG是一種新型帶熒光的葡萄糖類似物，在2位C原子位置有一個修飾過的2-N-(7-nitrobenz-2-oxa-1，3-diazol-4-yl)氨基酸基團[6]。該熒光試劑激發熒光最佳波長為發射波長542 nm、激發波長467 nm。D-葡萄糖通過葡萄糖轉運子(glucose transporter，GLUT)的轉運進入細胞。已有實驗證明，D-葡萄糖可抑制細胞攝取2-NBDG，而L-葡萄糖不會呈現類似的抑制效果，這表明2-NBDG和D-葡萄糖是通過競爭與GLUT的結合從而進入細胞[10-12]。研究表明，GLUT1在腫瘤細胞廣泛表達，包括肝癌細胞[13-14]，因此，2-NBDG可以被這些廣泛表達GLUT1的腫瘤細胞攝取，這與我們的實驗結果是一致的。

本研究設計不足之處是沒有設置正常肝細胞作為研究對照。但有相關文獻報道，非腫瘤細胞對2-NBDG的攝取和聚集僅為腫瘤細胞的20%[15]。因此，2-NBDG是一種很好的熒光探針，已經在臨床前和臨床腫瘤靶向診斷、監測治療效果和靶向治療中被廣泛研究[16-17]。

綜上所述，2-NBDG可被肝癌細胞BEL-7402快速攝取，并可通過熒光強度的方式量化其攝取程度，D-葡萄糖可競爭性抑制肝癌細胞BEL-7402對2-NBDG攝取。因此，2-NBDG可作為肝癌細胞的葡萄糖代謝熒光標記應用于診斷體外培養的肝癌細胞BEL-7402，這種帶熒光的葡萄糖類似物有望為肝癌的診斷和治療提供新的方式。

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Value of 2-NBDG as a fluorescent probe for BEL-7402 human hepatocarcinoma cells

LYULiang1,TANGHuan-huan1,YANGYan-li1,YUANBo1,CHENMeng-qing1,CHENGao-jian1,ZHANGKe-feng1,LUXi2,ZHONGMing-li1,XUQing1,WEIJing-chen1,LUOYan1,WEIGui-jiao1,JIANGLu-hui1,DUANXiao-qun1

(1SchoolofPharmacy,2SchoolofBiotechnology,GuilinMedicalUniversity,Guilin541004,China)

Objective To evaluate the value of D-glucose analog(2-NBDG) as a fluorescent probe for BEL-7402 human hepatocarcinoma cells.Methods BEL-7402 human hepatocarcinoma cell strains were divided into experimental group with 5 mmol/L D-glucose and control group without 5 mmol/L D-glucose after 24 hours of culture.The two groups were divided into subgroups,and then were added with 2-NBDG with different concentrations(0.3 mmol/L and 1 mmol/L).There were 4 groups obtained,including 0.3 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-glucose group,1 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-glucose group,0.3 mmol/L 2-NBDG group and 1 mmol/L 2-NBDG group.The fluorescence intensities were compared among the 4 groups.The intake and fluorescence imaging of 2-NBDG in BEL-7402 human hepatocarcinoma cells were analyzed.And the competitive antagonism of 2-NBDG by D-glucose was also assessed.Results The relative fluorescence intensity of 0.3 mmol/L 2-NBDG group was (78.72±3.78)%,and was lower than that of 1 mmol/L 2-NBDG group[(100.00±8.23)%](P<0.05).The relative fluorescence intensity of 0.3 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-glucose group was (20.67±1.46)%,and was significantly lower than that of 0.3 mmol/L 2-NBDG group[(78.72±3.78)%](P<0.05).The relative fluorescence intensity of 1 mmol/L 2-NBDG+5 mmol/L D-glucose group was (22.23±2.01)%,and was significantly lower than that of 1 mmol/L 2-NBDG group[(100.00±8.23)%](P<0.05).Conclusion BEL-7402 human hepatocarcinoma cells can intake 2-NBDG rapidly,and the intake can be assessed quantitatively by the fluorescence intensity.D-glucose might competitively inhibit the intake of 2-NBDG in BEL-7402 hepatocarcinoma cells.2-NBDG can be taken as a fluorescent probe for BEL-7402 human hepatocarcinoma cells. 【Key words】 Hepatocarcinoma,BEL-7402 hepatocarcinoma cell,2-NBDG,Fluorescent probe,Glucose intake,Diagnosis

國家自然科學基金(81460619)；廣西科技基礎條件平臺建設項目(132907)

呂良(1980～)，男，博士，講師，研究方向：藥理學。

段小群(1972～)，男，博士，教授，研究方向：藥物開發與藥理學，E-mail：xiaoqunduan@163.com。

R 735.7

A

0253-4304(2016)02-0149-03

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.02.01

2015-11-01

2015-12-16)