降調(diào)ACSS2對非小細胞肺癌A549細胞增殖、凋亡和遷移的影響

盧曉霞，常 淑，畢明宏，王雅萍

1.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，安徽 蚌埠 233000；

2.蚌埠醫(yī)學(xué)院組織移植安徽省重點實驗室，安徽 蚌埠 233000；

3.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院圖書館，安徽 蚌埠 233000

降調(diào)ACSS2對非小細胞肺癌A549細胞增殖、凋亡和遷移的影響

盧曉霞1,2，常 淑3，畢明宏1，王雅萍1

1.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，安徽 蚌埠 233000；

2.蚌埠醫(yī)學(xué)院組織移植安徽省重點實驗室，安徽 蚌埠 233000；

3.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院圖書館，安徽 蚌埠 233000

背景與目的：代謝水平的改變是腫瘤細胞生長的主要特征之一，有研究證實，乙酰輔酶A合成酶2(cytosolic acetyl-CoA synthetase 2，ACSS2)在腫瘤細胞的代謝中起著至關(guān)重要的作用。本研究擬通過RNA干擾技術(shù)抑制非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)A549細胞中ACSS2的表達，探討ACSS2對A549細胞增殖、凋亡和遷移的影響。方法：設(shè)計并合成針對ACSS2的特異性干擾片段ACSS2-siRNA及與ACSS2沒有同源性的陰性對照，瞬時轉(zhuǎn)染NSCLC A549細胞，通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)檢測ACSS2 mRNA的表達情況，四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)實驗檢測轉(zhuǎn)染組與對照組細胞的增殖情況，流式細胞儀檢測細胞的凋亡率，細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力。結(jié)果：通過轉(zhuǎn)染體外合成的干擾片段ACSS2-siRNA，NSCLC A549細胞中ACSS2 mRNA呈顯著低表達。ACSS2-siRNA干擾組的細胞較對照組增殖活性明顯減弱，凋亡增加，遷移能力減弱。結(jié)論：降調(diào)ACSS2表達能顯著抑制A549細胞增殖、遷移能力，促進凋亡尤其是早期凋亡明顯增加。

肺腫瘤；乙酰輔酶A合成酶2；RNA干擾

據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)2012年統(tǒng)計，肺癌的新發(fā)病例數(shù)約為180萬，占癌癥總數(shù)的1 2.9%，約占死亡人數(shù)的20%［1］。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)在肺癌中約占85%～90%［2］。雖然現(xiàn)有的系統(tǒng)性化療、放療和分子靶向治療等治療手段不斷進展，但由于目前大多數(shù)患者在診斷時已屬晚期而失去手術(shù)機會，其死亡率仍然居高不下。有研究顯示，惡性腫瘤細胞的特征包括共同的自給自足生長信號、生長不敏感信號、逃避凋亡、無限復(fù)制的潛力、持續(xù)的血管生成、組織侵襲和轉(zhuǎn)移［3］。腫瘤細胞代謝的改變可以認為是其第七大重要特征。Warburg等［4］比較正常肝細胞和肝癌細胞的代謝特點時發(fā)現(xiàn)，癌細胞的葡萄糖攝取能力及糖酵解代謝增強，呈現(xiàn)葡萄糖的高攝取率、糖酵解代謝增強及代謝產(chǎn)物乳酸增加的現(xiàn)象，被稱為瓦爾堡效應(yīng)。細胞生長、增殖與代謝是密切配合的。腫瘤細胞在營養(yǎng)受限的情況下可以通過代謝途徑增強增殖能力的說法仍然存在爭議。目前，對于腫瘤細胞在代謝的哪些方面可能具有臨床意義的易損靶點尚不明確［5］。乙酰輔酶A是三大營養(yǎng)物質(zhì)代謝的核心，在能量代謝、基因表達和細胞增殖等方面起著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在低氧及其脂類物質(zhì)耗盡的情況下，乙酰輔酶A主要依靠乙酰輔酶A合成酶2(cytosolic acetyl-CoA synthetase 2，ACSS2)催化乙酸鹽生成［6］。

臨床影像學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，人類多數(shù)腫瘤都有對于乙酸鹽的活躍吸收，包括前列腺、肝、肺和腦部腫瘤［7-9］。ACSS2在多種腫瘤中高表達，而在相應(yīng)正常組織中低或無表達。Schug等［10］報道在新陳代謝應(yīng)激的情況下ACSS2表達呈上調(diào)趨勢，沉默ACSS2表達可以抑制移植瘤的生長，可見在低氧或脂類耗盡的情況下，ACS22對于腫瘤細胞的生長起重要作用。本研究擬在細胞水平探索ACSS2的生物學(xué)功能。利用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)在肺癌A549細胞中降調(diào)ACSS2，用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(realtime fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)技術(shù)檢測ACSS2 mRNA的表達水平。應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、流式細胞術(shù)和細胞劃痕實驗檢測ACSS2對細胞增殖、凋亡和遷移能力的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)

NSCLC細胞株A549與正常支氣管上皮細胞株16HBE購自上海耀新生物科技有限公司，采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及0.1 mg/mL鏈霉素的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液，于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 RTFQ-PCR檢測細胞中ACSS2表達情況

按照Trizol試劑說明書提取A549細胞和16HBE細胞RNA，使用紫外分光光度儀分析純度及濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作方法將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

通過Genebank設(shè)計ACSS2 PCR擴增引物序列，通過Primer-Blast同源性檢測證實目的基因序列為293 bp，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用于RTFQ-PCR的引物ACSS2正義序列：5’-CTGCTACTTTCCCATTCTTT-3’，反義序列：5’-CTCCACCTCTGCTGTACTCA-3’。β-actin購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

使用日本TaKaRa公司的SYBR? Premix Dimer Eraser?(Perfect Real Time)試劑盒進行RTFQ-PCR實驗，方法與步驟按照說明書進行。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，56.9 ℃退火30 s，72 ℃延伸34 s，共40個循環(huán)擴增。記錄各樣品Ct值，計算各組目的基因相對表達量。△CtACSS2=CtACSS2-Ctβ-actin；△△Ct=△Ct腫瘤-△Ct正常平均值；目的基因相對表達量(relative quantification，RQ)為2-△△Ct。

1.3 siRNAs的序列合成與轉(zhuǎn)染

1.3.1 siRNAs序列合成

ACSS2-siRNAs序列片段由上海吉瑪生物制藥公司設(shè)計合成。目的序列正義鏈：5’-GCGAGUGCUUCGGAAGAUUTT-3’；反義鏈：5’-AAUCUUCCGAAGCACUCGCTT- 3’；陰性對照序列正義鏈：5’-UUCUCCGAACG UGUCACGUTT-3’；反義鏈：5’-ACGUGA CACGUUCGGAGAATT-3’。

1.3.2 siRNAs轉(zhuǎn)染

選用生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞進行轉(zhuǎn)染，實驗步驟參照上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司轉(zhuǎn)染手冊及LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說明。轉(zhuǎn)染細胞分為實驗組、陰性對照組和空白對照組。具體如下(以24孔板為例，其他孔相應(yīng)調(diào)整)。轉(zhuǎn)染前1天，將1.0×105個細胞接種在24孔板上，在24 h內(nèi)細胞匯合達50%～70%。經(jīng)預(yù)實驗優(yōu)化試劑用量分別為20 pmol siRNA和2 μL LipofectamineTM2000，培養(yǎng)基最終體積為500 μL/孔。轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，12 h內(nèi)進行流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率。24～72 h后收獲細胞進行轉(zhuǎn)染后的其他實驗。

1.4 RNA干擾效果鑒定

1.4.1 流式細胞儀檢測5(6)-羧酸熒光素標記的ACSS2-siRNA轉(zhuǎn)染情況

脂質(zhì)體介導(dǎo)的5(6)-羧酸熒光素標記的ACSS2-siRNA轉(zhuǎn)染步驟同上，轉(zhuǎn)染后將細胞置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的恒溫箱中避光培養(yǎng)。6～8 h后取出細胞，經(jīng)PBS洗滌3遍后，在4 ℃的條件下，223.8×g離心5 min，收集細胞進行流式細胞術(shù)轉(zhuǎn)染效率檢測。

1.4.2 RTFQ-PCR

按照Trizol試劑說明書提取轉(zhuǎn)染前和轉(zhuǎn)染后A549細胞RNA，使用紫外分光光度儀分析純度及濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作方法將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR? Premix Dimer Eraser?(Perfect Real Time)試劑盒進行RTFQ-PCR實驗，方法與步驟按照說明書進行。反應(yīng)條件為：95.0 ℃預(yù)變性30 s，95.0 ℃變性5 s，56.9 ℃退火30 s，72.0 ℃延伸34 s，共40個循環(huán)擴增。記錄各樣品Ct值，計算各組目的基因相對表達量。△CtACSS2=CtACSS2-Ctβ-actin；△△Ct=△Ct腫瘤-△Ct正常平均值；目的基因RQ為 2-△△Ct。

1.5 MTT法檢測細胞增殖

將處于對數(shù)期的細胞接種于96孔板，進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染細胞分為實驗組、陰性對照組和未處理組。分別在轉(zhuǎn)染后24、48、72和96 h加入濃度為5 mg/mL的MTT 20 μL，混勻，避光溫育4 h。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，室溫下避光振蕩10 min。酶標儀檢測490 nm處吸光度(D)值。實驗重復(fù)3次，按以下公式計算細胞增殖抑制率(%)：細胞增殖抑制率=(1-實驗組D值/對照組D值)×100%，繪制生長曲線。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

將處于對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板，于37℃、CO2體積分數(shù)為5%的恒溫箱中溫育24 h后進行LipofectamineTM2000介導(dǎo)的siRNA轉(zhuǎn)染，分為實驗組、陰性對照組和未處理組。48 h后計數(shù)，以每管取5×105個細胞移至流式管中，按照凋亡檢測試劑盒說明書步驟操作如下：加入500 μL的Binding Buffer懸浮細胞后加入5μL Annexin V-FITC混勻，繼續(xù)加入5 μL Propidiμm Iodide，混勻；室溫、避光反應(yīng)5～15 min；在1 h內(nèi)，采用流式細胞儀檢測。每組重復(fù)3次(轉(zhuǎn)染后處理細胞過程均以強光照射，總照射時間大于1 h，于熒光顯微鏡下觀察無綠色熒光)。

1.7 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力

將處于對數(shù)期的細胞接種于6孔板，進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染細胞分為實驗組、陰性對照組和未處理組，于24 h鋪滿6孔板，進行劃痕。采用含3%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液，于37 ℃、C02體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。分別在轉(zhuǎn)染后0、24和48 h觀察細胞愈合程度并拍照。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 RTFQ-PCR檢測肺癌細胞A549中ACSS2呈高表達

通過RTFQ-PCR檢測NSCLC A549細胞與正常支氣管上皮細胞株16HBE中ACSS2 mRNA的表達情況。結(jié)果顯示，A549中ACSS2的相對表達量約為正常支氣管上皮細胞株16HBE的(2.61±0.05)倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

圖 1 RTFQ-PCR檢測ACSS2 mRNA在NSCLC細胞株及正常支氣管上皮細胞株中的表達Fig. 1 The expression of ACSS2 mRNA in bronchial epithelial cell and NSCLC cells detected by RTFQ-PCR

2.2 siRNA轉(zhuǎn)染細胞效果檢測

使用流式細胞儀對轉(zhuǎn)染后標記有5(6)-羧酸熒光素的細胞進行轉(zhuǎn)染效率檢測，轉(zhuǎn)染效率大于70%(圖2)。

圖 2 流式細胞儀檢測細胞轉(zhuǎn)染效率Fig. 2 The transfection efficiency of ACSS2 siRNA

2.3 轉(zhuǎn)染ACSS2-siRNA能沉默ACSS2 mRNA表達

對轉(zhuǎn)染后72 h的細胞進行RTFQ-PCR檢測。結(jié)果顯示，ACSS2-siRNA干擾組ACSS2mRNA表達量(0.26±0.44)較空白對照組(1.00±0.51)及陰性對照組(1.06±0.40)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，陰性對照組與空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)。

圖 3 RTFQ-PCR檢測轉(zhuǎn)染后ACSS2基因mRNA的表達水平Fig. 3 RTFQ-PCR was used to detect the expression of ACSS2 mRNA

2.4 轉(zhuǎn)染ACSS2-siRNA能抑制A549細胞增殖

MTT法檢測轉(zhuǎn)染后24、48、72和96 h ACSS2-siRNA對NSCLC細胞系A(chǔ)549的生長抑制作用，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后24、48、72和96 h，siACSS2對細胞的生長抑制率分別為(8.5±5.2)%、(17.3±3.6)%、(22.9±4.1)%和(29.7±6.5)%，與對照組相比，轉(zhuǎn)染后24 h細胞抑制率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.06)，48、72和96 h細胞抑制率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，降調(diào)ACSS2可明顯抑制細胞增殖(圖4)。

2.5 轉(zhuǎn)染ACSS2-siRNA能促進細胞凋亡

流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染ACSS2-siRNA對A549細胞凋亡的影響，siACSS2轉(zhuǎn)染后48 h，使用流式細胞儀對三組細胞進行細胞凋亡分析，結(jié)果顯示，ACSS2-siRNA轉(zhuǎn)染組較陰性對照組及空白對照組細胞凋亡率明顯上升，早期細胞凋亡率分別為21.60±2.92、5.70±2.51和8.50±1.60，ACSS2-siRNA轉(zhuǎn)染組細胞早期凋亡率明顯高于陰性對照組及空白對照組(P<0.05)，而后兩者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明降調(diào)ACSS2能夠促進肺癌細胞A549發(fā)生早期凋亡(圖5)。

2.6 轉(zhuǎn)染ACSS2-siRNA能抑制細胞遷移

細胞劃痕實驗檢測ACSS2-siRNA對細胞遷移能力的影響，結(jié)果應(yīng)用Image-Pro plus 6.0分析，分別測量0、24和48 h的劃痕寬度，平均遷移距離=(0 h的劃痕寬度－24或48 h的劃痕寬度)/2。24 h實驗組細胞平均遷移(32.6±5.8) μm，陰性對照組平均遷移(44.6±8.4) μm，空白對照組平均遷移(42.9±8.0) μm，三組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。48 h實驗組細胞平均遷移(83.1±7.7) μm，陰性對照組平均遷移(120.3±8.3) μm，空白對照組平均遷移(125.5±7.6) μm，實驗組與空白對照組細胞遷移距離差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖6)。

圖 4 MTT檢測ACSS2-siRNA轉(zhuǎn)染對A549細胞的生長抑制作用Fig. 4 MTT was used to test the inhibition of cell growth after ACSS2-siRNA transfection

圖 5 降調(diào)ACSS2表達對NSCLC A549細胞凋亡率的影響Fig. 5 The impact of ACSS2 knockdown on apoptosis rate of NSCLC cell A549

圖 6 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力Fig. 6 Wound healing assay was used to detect cell migration

3 討 論

肝癌腫瘤模型的研究結(jié)果顯示，ACSS2基因的缺失降低了腫瘤的發(fā)生率［5］。Mashimo等［11］認為ACSS2在腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤及其轉(zhuǎn)移腫瘤中表達上調(diào)并且具有廣泛的免疫反應(yīng)性。另外在Ⅱ、Ⅲ期惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤中患者生存時間短可能與ACSS2高表達相關(guān)。提示ACSS2可能是潛在的腫瘤治療的靶點或者是評價預(yù)后的可能指標。

本研究前期在組織水平證實，NSCLC的癌組織中存在ACSS2高表達，而正常肺組織表達量極少。現(xiàn)通過體外細胞培養(yǎng)進一步探索了ACSS2對于NSCLC A549細胞的生物學(xué)功能的影響。實驗利用RNA干擾技術(shù)設(shè)計合成siRNA片段，通過LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)入A549細胞內(nèi)，經(jīng)流式細胞儀鑒定其轉(zhuǎn)染效率大于70%，RTFQ-PCR驗證細胞ACSS2 mRNA表達明顯下調(diào)。通過MTT、細胞劃痕實驗檢測細胞增殖及遷移能力減弱，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡能力增強。提示ACSS2在肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起重要作用，其表達量的多少對A549細胞的生物學(xué)功能有重要影響。但是其在體內(nèi)對于NSCLC細胞的生長、轉(zhuǎn)移是否至關(guān)重要，降調(diào)ACSS2能否顯著抑制NSCLC的發(fā)生、發(fā)展，是否能通過其預(yù)測患者預(yù)后尚需要進一步更深入的研究。本研究在體外細胞水平上是通過肺腺癌細胞株A549進行的，A549細胞不能夠完全代表其他類型的NSCLC，體外細胞實驗不能夠完全模擬體內(nèi)生理環(huán)境，故實驗存在一定的局限性。本研究通過ACSS2-siRNA干擾技術(shù)降調(diào)ACSS2表達，但只進行了基因水平的鑒定，下一步應(yīng)該在蛋白水平進行鑒定其是否有蛋白表達量的減少。另外，動物水平及與臨床治療有關(guān)的研究也是后續(xù)研究的方向。在機制研究方面，需要更深入的研究，尋找其具體參與的分子調(diào)控機制。為肺癌的靶向治療及預(yù)后評價方面提供依據(jù)。

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The influence of ACSS2 knockdown on the proliferation, apoptosis and migration of NSCLC cell line A549

LU Xiaoxia1,2, CHANG Shu3, BI Minghong1, WANG Yaping1(1. Department of Medical Oncology, the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, Bengbu 233000, Anhui Province, China; 2. Anhui Key Laboratory of Tissue Transplantation of Bengbu Medical College, Bengbu 233000, Anhui Province, China; 3. Department of Library, the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, Bengbu 233000, Anhui Province, China)

Background and purpose:Metabolism change is one of the main characteristics of the tumor development. Many studies have confirmed that cytosolic acetyl-CoA synthetase 2 (ACSS2) plays a critical role in hydrocarbon metabolism of cancer cells. This study aimed to explore the effect of ACSS2 on cellular proliferation, apoptosis and migration of A549 cells by RNA interference.Methods:The ACSS2 interference fragment ACSS2-siRNA and negative control were designed and synthesized for RNA interference followed by the transient transfection in non-small cell lung cancer (NSCLC) cell line A549. Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RTFQ-PCR) was used to detect ACSS2 mRNA expression. Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT), flow cytometry and wound healing assay were used to detect cell proliferation, apoptosis rate and migration.Results:The expression of ACSS2 mRNA was significantly decreased after transfection with the interference fragment ACSS2-siRNA in NSCLC cell line A549. The proliferation and migration activity of ACSS2-siRNA treated cells were decreased significantly compared with the control group. The apoptosis rate, especially the early apoptosis, was increased..Conclusion:Knockdown of the ACSS2 expression in NSCLC cell line A549 can significantly inhibit the cell proliferation, migration ability and pro-mote the apoptosis rate, especially early apoptosis. This study indicates that ACSS2 may contribute to the progression of human lung adenocarcinoma and may have the potential to serve as a novel therapeutic target.

Lung neoplasm; Cytosolic acetyl-CoA synthetase 2; RNA interference

10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.12.003

R734.2

A

1007-3639(2016)12-0974-07

2016-05-25

2016-07-18）

畢明宏 E-mail: bmh2003@126.com