水通道蛋白4對肺癌細胞A549遷移能力的影響及其作用機制研究

周永春，張 琦，陳琬玲，方 育，李融林，張 璟，王 倩，師 毅

·論著·

水通道蛋白4對肺癌細胞A549遷移能力的影響及其作用機制研究

周永春，張 琦，陳琬玲，方 育，李融林，張 璟，王 倩，師 毅

目的 探討水通道蛋白4(AQP4)對肺癌細胞遷移能力的影響。方法 選取肺癌A549細胞株，采用AQP4小干擾RNA(siRNAs)進行轉染，采用Transwell法檢測腫瘤細胞遷移能力，采用蛋白質印跡(Western blotting)法檢測上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)、神經型鈣黏蛋白 (N-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)表達水平，同時分析其對上皮間質轉化(EMT)的影響。結果 敲降AQP4可抑制肺癌細胞A549遷移能力及EMT，上調E-cadherin表達水平并下調N-cadherin和Vimentin表達水平(P<0.05)。結論 抑制AQP4表達可有效降低肺癌細胞A549遷移能力并抑制EMT，推測促進EMT可能是AQP4的主要分子作用機制。

肺腫瘤；水通道蛋白質4；細胞遷移抑制；藥理作用分子作用機制

周永春，張琦，陳琬玲，等.水通道蛋白4對肺癌細胞A549遷移能力的影響及其作用機制研究[J].實用心腦肺血管病雜志，2016，24(12)：55-58.[www.syxnf.net]

ZHOU Y C，ZHANG Q，CHEN W L，et al.Impact of aquaporin 4 on migration of lung cancer A549 cells and the mechanism[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2016，24(12)：55-58.

肺癌發病率和病死率均較高，且近年來呈逐年升高趨勢；非小細胞肺癌(NSCLC)約占所有肺癌的80%，小細胞肺癌(SCLC)約占20%[1-2]。第三次全國居民死亡原因調查結果顯示，過去30年間我國肺癌患者病死率升高了46.5%，肺癌病死率已位居所有癌癥第一位[1]。雖然我國目前醫療診治水平有了很大提高，但肺癌患者5年生存率仍不足15%[3]。

水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一組與水及部分小分子通透性相關的細胞膜轉運蛋白，近年研究結果顯示，AQP1、AQP3及AQP5等在肺癌細胞增殖和遷移過程中發揮著重要作用[4-10]，但目前關于AQP4對肺癌細胞增殖、遷移等影響及其作用機制的研究報道較少。本研究旨在探討AQP4對肺癌細胞A549遷移能力的影響及其作用機制，以期為肺癌的靶向治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞株 肺癌A549細胞株購自中國科學院昆明動物研究所，細胞生長狀況良好。

1.2 試劑 Hyclone胎牛血清(FBS)；Transwell和lipofectamine 2000由ThermoFisher Scientific提供；小干擾RNA(siRNAs)由上海吉瑪生物科技有限公司提供；肌動蛋白(β-actin)、AQP4、上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)、神經型鈣黏蛋白(N-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)抗體由Santa Cruz Biotechnology提供。

1.3 細胞培養及轉染 將肺癌細胞A549置于含10%FBS的RPMI-1640培養基，于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養箱內培養，待細胞長至瓶底約80%時采用胰酶消化、傳代，取對數生長期細胞進行實驗；于轉染前24 h將處于對數生長期的細胞接種到6孔板，采用lipofectamine 2000進行細胞轉染，轉染過程嚴格按照說明書進行操作；轉染24 h后采用Transwell法檢測細胞遷移能力，轉染48 h后收集蛋白樣品采用蛋白質印跡(Western blotting)法檢測上皮間質轉化(EMT)相關蛋白〔上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)、神經型鈣黏蛋白 (N-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)〕表達水平。AQP4-siRNA-1序列為5′-GGUCUCCUGGUAGAGUUGAUAAUCA-3′，AQP4-siRNA-2序列為5′-GCTCAATAGCTTTAGCAATTG-3′，對照-siRNA(Negative Control)序列為5′-GGUCCGUUGGAGAUUAGAUAUCUCA-3′。

1.4 Transwell檢測方法 取AQP4-siRNAs轉染的肺癌細胞A549，靜置24 h后消化、離心，采用含0.1%牛血清清蛋白(BSA)的無血清培養基進行混懸、稀釋并計數細胞數，調整細胞數為1×105，吸取100 μl細胞懸液加入Transwell小室的上室，下室中加入含10%FBS的RPMI-1640培養基；置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱內培養36 h，取出上室并自然風干，采用多聚甲醛固定15 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2 min后采用0.1%結晶紫染色，于100倍光鏡下隨機選取10個視野進行觀察并計數細胞數，重復3次取平均值。

1.5 RT-PCR 取對數生長期肺癌細胞A549，轉染AQP4-siRNAs 48 h后采用0.25%胰酶消化，加入Trizol試劑1 ml，混勻后提取總RNA；采用紫外分光光度計檢測RNA中R值，根據公式A260/A280計算RNA總濃度。反轉錄反應體系：于0.2 ml EP管中加入10 μmol/L Oligo(dT)1 μl、總RNA 8 μl、焦碳酸二乙酯(DEPC)水3 μl，混勻后離心；于PCR儀上65 ℃加熱5 min，之后冰浴3 min；在上述EP管中加入10 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)Mix 2 μl、5×Reaction Buffer 4.0 μl、RevertAidM-MuLV Reverse Transcniptase 1 μl、RibolockRnase inhibitor 1 μl；42 ℃加熱60 min，70 ℃加熱5 min；最后將得到的總RNA與合成的cDNA在-20 ℃冰箱中保存待測。熒光定量檢測方法：采用20 μl反應體系，包括cDNA 2 μl，10 μmol/L引物1 μl，Takara的SYBR premix Ex Taq Ⅱ 10 μl，DEPC水7 μl。反應條件：95 ℃預變性30 s，循環40次(95 ℃變性5 s，60 ℃退火和延伸34 s)，然后導出溶解曲線。引物序列如下：ZEB1上游引物：5′-CTACTCAACTACGGTCAGCCC-3′，ZEB1下游引物：5′-TTGGGCGGTGTAGAATCAGAG-3′；SNAIL上游引物：5′-TCCCTGTCAGATGAGGACAGT-3′，SNAIL下游引物：5′-TTTCGAGCCTGGAGATCCTTG-3′；基質金屬蛋白酶9(MMP-9)上游引物：5′- GTACTGGCGATTCTCTGAGGG-3′，MMP-9下游引物：5′- CTCAAAGACCGAGTCCAGCTT-3′；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)上游引物：5′-AAATCCCATCACCATCTTCCAG-3′，GAPDH下游引物：5′-GAGTCCTTCCACGATACCAAAGTTG-3′。內參基因為GAPDH，相對表達量采用2ΔΔCt法計算。

1.6 蛋白質印跡法 采用AQP4-siRNAs轉染的肺癌細胞A549，靜置48 h后于冰上操作，刮下細胞并移至1.5 ml EP管；每瓶加250～500 μl放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液，1 200 r/min離心5 min，收集蛋白；采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，之后將蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上；采用5%脫脂奶粉在室溫下封閉1 h，一抗室溫孵育2～3 h，二抗室溫孵育1 h；室溫下將ECL混合液滴加在PVDF膜上，避光反應3～5 min，顯影、定影；以β-actin為內參。

1.7 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件處理數據，數據以箱式圖表示，采用Student′t檢驗；以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AQP4表達水平 與對照-siRNA比較，AQP4-siRNAs-1、AQP4-siRNAs-2轉染的AQP4表達均降低(見圖1)。

2.2 肺癌細胞A549遷移能力 與對照-siRNA比較，AQP4-siRNAs-1、AQP4-siRNAs-2轉染的肺癌細胞A549遷移能力明顯降低(P<0.05，見圖2)。

2.3 E-cadherin、N-cadherin及Vimentin表達水平 與對照-siRNA比較，AQP4-siRNAs-1、AQP4-siRNAs-2轉染的E-cadherin表達水平升高，N-cadherin和Vimentin表達水平降低(見圖3)；ZEB1和SNAIL mRNA表達水平降低(見圖4、5)；MMP-9表達水平降低(見圖6)。

注：NC=對照-siRNA，AQP4=水通道蛋白4，siRNA=小干擾RNA，β-actin=肌動蛋白

圖1 AQP4-siRNAs可降低AQP4表達水平

Figure 1 AQP4-siRNAs significantly down-regulated the protein expression of AQP4

注：A為0.1%結晶紫染色圖，B為箱式圖；與對照-siRNA比較，aP<0.001

圖2 敲降AQP4可抑制肺癌細胞A549的遷移

Figure 2 Knockdown of AQP4 significantly inhibited the migration of lung cancer A549 cells

注：E-cadherin=上皮型鈣黏蛋白，N-cadherin=神經型鈣黏蛋白，Vimentin=波形蛋白

圖3 敲降AQP4可抑制肺癌細胞A549 EMT

Figure 3 Knockdown of AQP4 significantly inhibited the EMT of lung cancer A549 cells

注：與對照-siRNA比較，aP<0.01，bP<0.001

圖4 敲降AQP4可抑制肺癌細胞A549中ZEB1 mRNA表達

Figure 4 Knockdown of AQP4 significantly reduced the mRNA expression of ZEB1 of lung cancer A549 cells

注：與對照-siRNA比較，aP<0.01，bP<0.001

圖5 敲降AQP4可抑制肺癌細胞A549中SNAIL mRNA表達

Figure 5 Knockdown of AQP4 significantly reduced the mRNA expression of SNAIL of lung cancer A549 cells

注：與對照-siRNA比較，aP<0.001

圖6 敲降AQP4可抑制肺癌細胞A549中MMP-9的表達

Figure 6 Knockdown of AQP4 significantly reduced the expression of MMP-9 of lung cancer A549 cells

3 討論

肺癌是目前全球范圍內對人類身體健康和生命安全危害較大的惡性腫瘤之一，全球肺癌發病率約為20/100 000人，我國約為22/100 000人。外科手術是治療肺癌的主要手段之一，雖然近年來手術技術及方式等取得了較大進展，但肺癌患者生存率并未得到有效提高；放療、化療毒副作用較大，且部分肺癌患者治療反應較差。因此，探討肺癌的發病機制、尋找抗腫瘤治療新靶點仍是當前研究熱點、難點之一。

近年研究表明，AQPs廣泛存在于人體肺、胃、腸、腎、腦等器官組織中，且其在腫瘤的發生發展中發揮著重要作用[4-10]，西妥昔單抗和阿法替尼可通過有效降低AQP1的表達而抑制肺癌細胞增殖并誘導癌細胞凋亡[11]。WEI等[5]研究發現，敲降AQP1可有效抑制肺癌細胞增殖及遷移能力，而抑制AQP3的表達可有效降低低氧誘導的NSCLC細胞生長[4，6]，提示AQP1和AQP3在肺癌細胞增殖、遷移過程中發揮著重要作用。有研究發現，AQP4在宮頸上皮內瘤變組織中的表達水平明顯高于正常宮頸上皮，且其在原發性膠質瘤組織中的表達水平也明顯升高[12-14]，但目前關于AQP4在肺癌中的作用機制尤其是分子作用機制的研究報道較少。

LI等[15]近期研究結果顯示，沉默乳腺癌細胞T47D和MCF-7 AQP4可有效抑制癌細胞增殖、遷移及侵襲，同時還可上調E-cadherin的表達。也有研究表明，AQP4在肺癌細胞中呈高表達，敲降AQP4可明顯降低肺癌細胞遷移能力[16-17]，但目前關于AQP4影響肺癌細胞遷移能力的分子作用機制尚不清楚。EMT是導致腫瘤細胞遷移能力增強并最終引起腫瘤轉移的重要生物學過程[13，18-19]，E-cadherin表達降低和N-cadherin、Vimentin表達升高是反映EMT的重要指標[20-21]。本研究結果顯示，敲降AQP4可上調肺癌細胞A549 E-cadherin的表達，下調N-cadherin和Vimentin的表達，提示沉默AQP4可有效抑制肺癌細胞EMT。鑒于EMT是腫瘤細胞遷移及轉移的重要生物學過程，因此推測AQP4可通過促進EMT而增強肺癌細胞遷移能力。本研究結果還顯示，敲降AQP4可通過降低E-cadherin而抑制ZEB1 mRNA和SNAIL mRNA的 表達及MMP-9的激活，進而抑制EMT。

綜上所述，AQP4高表達參與了肺癌的發生發展，抑制其表達可有效降低肺癌細胞A549遷移能力并有效抑制EMT，推測促進EMT可能是AQP4的主要分子作用機制。

[1]HALL Z，AMENT Z，WILSON C H.Myc expression drives aberrant lipid metabolism in lung cancer[J].Cancer Res，2016，76(16)：4608-4618.

[2]MELOSKY B，AGULNIK J，ALBADINE R，et al.Canadian consensus：inhibition of ALK-positive tumours in advanced non-small-cell lung cancer[J].Curr Oncol，2016，23(3)：196-200.

[3]PARKIN D M，BRAY F，FERLAY J，et al.Global cancer statistics，2002[J].CA Cancer J Clin，2005，55(2)：74-108.

[4]HOU S Y，LI Y P，WANG J H，et al.Aquaporin-3 inhibition reduces the growth of NSCLC cells induced by hypoxia[J].Cell Physiol Biochem，2016，38(1)：129-140.

[5]WEI X B，DONG J C.Aquaporin 1 promotes the proliferation and migration of lung cancer cell in vitro[J].Oncol Rep，2015，34(3)：1440-1448.

[6]XIA H，MA Y FU，YU C H，et al.Aquaporin 3 knockdown suppresses tumour growth and angiogenesis in experimental non-small cell lung cancer[J].Exp Physiol，2014，99(7)：974-984.

[7]CHAE Y K，WOO J，KIM M J，et al.Expression of aquaporin 5(AQP5)promotes tumor invasion in human non small cell lung cancer[J].PLoS One，2008，3(5)：e2162.

[8]XIANG Y，MA B，LI T，et al.Acetazolamide inhibits aquaporin-1 protein expression and angiogenesis[J].Acta Pharmacol Sin，2004，25(6)：812-816.

[9]VERKMAN A S.Novel roles of aquaporins revealed by phenotype analysis of knockout mice[J].Rev Physiol Biochem Pharmacol，2005，155：31-55.

[10]ZHANG H，SHAO H，GOLUBOVSKAYA V M，et al.Efficacy of focal adhesion kinase inhibition in non-small cell lung cancer with oncogenically activated MAPK pathways[J].Br H Cancer，2016，115(2)：203-211.

[11]LIU Y H，ZHU W L.Effects of cetuximab combined with afatinib on the expression of KDR and AQP1 in lung cancer[J].Genet Mol Res，2015，14(4)：16652-16661.

[12]SHEN Q，LIN W，LUO H，et al.Differential expression of aquaporins in cervical precursor lesions and invasive cervical cancer[J].2016，23(11)：1551-1558.

[13]BAEK S H，KO J H，LEE J H，et al.Ginkgolic Acid Inhibits Invasion and Migration and TGF-β-Induced EMT of lung cancer cells through PI3K/Akt/mTOR Inactivation[J].J Cell Physiol，2016，232(2)：346-354.

[14]MOBASHERI A，BARRETT-JOLLEY R.Aquaporin water channels in the mammary gland：from physiology to pathophysiology and neoplasia[J].J Mammary Gland Biol and Neoplasia，2014，19(1)：91-102.

[15]LI Y B，SUN S R，HAN X H.Down-regulation of AQP4 inhibits proliferation，migration and invasion of human breast cancer cells[J].Folia Biol(Praha)，2016，62(3)：131-137.

[16]WARTH A，MULEY T，MEISTER M，et al.Loss of aquaporin-4 expression and putative function in non-small cell lung cancer[J].BMC Cancer，2011，11：161.

[17]XIE Y P，WEN X H，JIANG Z Q，et al.Aquaporin 1 and aquaporin 4 are involved in invasion of lung cancer cells[J].Clin Lab，2012，58(1/2)：75-80.

[18]HUANG S F，HORNG C T，HSIEH Y S，et al.Epicatechin-3-gallate reverses TGF-β1-induced epithelial-to-mesenchymal transition and inhibits cell invasion and protease activities in human lung cancer cells[J].2016，Food Chem Toxicol，2016，94：1-10.

[19] KOHNOH T，HASHIMOTO N，ANDO A，et al.Hypoxia-induced modulation of PTEN activity and EMT phenotypes in lung cancers[J].2016，16：33.

[20]ZHENG N，HUO Z，ZHANG B，et al.Thrombomodulin reduces tumorigenic and metastatic potential of lung cancer cells by up-regulation of E-cadherin and down-regulation of N-cadherin expression[J].2016，Biochem Biophys Res Commun，2016，476(4)：252-259.

[21]LI Y，CHEN P，ZU L，et al.MicroRNA-338-3p suppresses metastasis of lung cancer cells by targeting the EMT regulator Sox4[J].Am J Cancer Res，2016，6(2)：127-140.

(本文編輯：王鳳微)

Impact of Aquaporin 4 on Migration of Lung Cancer A549 Cells and the Mechanism

ZHOUYong-chun，ZHANGQi，CHENWan-ling，FANGYu，LIRong-lin，ZHANGJing，WANGQian，SHIYi

.TheThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity(YunnanProvincialKeyLaboratoryforLungCancer)，Kunming650118，China

SHIYi，BloodTransfusionDepartment，DongguanBranchofAffiliatedHospitalofYan′anUniversity，Yan′an716000，China；E-mail：shiyandong0104@163.com

Objective To explore the impact of aquaporin 4(AQP4)on migration of lung cancer A549 cells and the mechanism.Methods We selected lung cancer A549 cells and transfected these cells by AQP4 siRNAs.Transwell assay was used to detect the tumor cell migration，Western blotting assay was used to detect the protein expressions of E-cadherin，N-cadherin and Vimentin，and the impact on epithelial-mesenchymal transition(EMT)was analyzed.Results Knockdown of AQP4 can significantly inhibite the migration and EMT of lung cancer A549 cells，up-regulate the E-cadherin protein expression and down-regulated the protein expressions of N-cadherin and Vimentin(P<0.05).Conclusion Knockdown of AQP4 may inhibite the migration and EMT of lung cancer A549 cells，promoting EMT may be the main molecular mechanism of AQP4.

Lung neoplasms；Aquaporin 4；Cell migration inhibition；Molecular mechanisms of pharmacological action

云南省教育廳科研基金重點項目(2013Z110)；云南省科技廳-昆明醫科大學聯合專項基金項目(2013FB132)

650118云南省昆明市，昆明醫科大學第三附屬醫院(云南省肺癌重點實驗室)(周永春)；昆明醫科大學第一附屬醫院胸外科(張琦，李融林，張璟)；中國人民武裝警察部隊云南省總隊醫院腫瘤科(陳琬玲)；昆明醫科大學第一附屬醫院麻醉科(方育)；南京總醫院消毒供應科(王倩)；延安延安大學附屬醫院東關分院輸血科(師毅)

師毅，716000陜西省延安市，延安大學附屬醫院東關分院輸血科；E-mail：shiyandong0104@163.com

R 734.2

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2016.12.014

2016-09-10；

2016-12-04)