人早孕蛻膜間充質干細胞移植治療大鼠宮腔粘連*

林鑫子，　黃晨玲子，　羅　新，　帥翰林

(暨南大學附屬第一醫院婦產科,廣東 廣州 510632)

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人早孕蛻膜間充質干細胞移植治療大鼠宮腔粘連*

林鑫子，黃晨玲子，羅新△，帥翰林△

(暨南大學附屬第一醫院婦產科,廣東 廣州 510632)

[摘要]目的： 探討人早孕蛻膜間充質干細胞(hDMSCs)治療大鼠宮腔粘連(IUA)的可行性和有效性。方法: 體外分離、培養、純化、鑒定hDMSCs。將30只雌性SD大鼠隨機分為3組：蛻膜間充質干細胞治療組(IUA+hDMSCs)、IUA模型組和假手術(sham)組，每組各10只。IUA+hDMSCs組和IUA組復制IUA模型后10 min內，IUA+hDMSCs組經尾靜脈注射2×106個Dio標記的hDMSCs，每3天補充1次，連續注射3次；IUA組經尾靜脈注射相同容量的PBS；sham組僅行開腹手術。3個動情周期后取子宮行HE染色和Masson染色，測量子宮內膜厚度、子宮內膜腺體數目、子宮內膜小血管數目和纖維化面積比率，并行免疫組化檢測子宮內膜組織細胞角蛋白、波形蛋白、轉化生長因子(TGF)-β1及整合素αγβ3的表達量，qPCR檢測IUA相關基因含量，免疫熒光觀察hDMSCs在內膜中的分布情況，并評估大鼠的生育能力。結果:IUA組部分子宮腔閉鎖，內膜萎縮，腺體減少，大量纖維化改變。IUA+hDMSCs組與IUA組相比子宮間質厚度明顯增加(P<0.05)，大量腺體增生和小血管新生(P<0.05)，纖維化程度減小(P<0.05)，與sham組比較無統計學差異。IUA+hDMSCs組細胞角蛋白、波形蛋白和整合素αγβ3表達量明顯高于IUA組(P<0.05)，而TGF-β1表達量低于IUA組(P<0.05)。qPCR結果顯示與IUA組相比，除TNF-α和結締組織生長因子下調外，IUA+hDMSCs組的干細胞因子、血管內皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和thrombospondin-1均明顯上調。免疫熒光結果顯示Dio-hDMSCs主要分布于腔上皮層，部分位于間質。IUA+hDMSCs組大鼠雙側子宮均妊娠，平均胎鼠數量與IUA組相比有統計學差異(P<0.05)。結論:hDMSCs可在受損的大鼠子宮內膜中存活、增殖，有效修復大鼠的子宮內膜，抑制IUA。

[關鍵詞]人早孕蛻膜間充質干細胞； 宮腔粘連; 大鼠

宮腔粘連(intrauterine adhesions，IUA)是由各種因素導致子宮內膜基底層損傷和感染引起的子宮頸管、子宮內膜和子宮肌層粘連，主要表現為宮腔變形、月經失調和不孕綜合征[1]。子宮內膜生理性修復是由位于子宮內膜基底層的干細胞不斷地增殖分化，形成新的功能層，因此宮腔粘連等子宮內膜修復障礙性疾病是由基底層干細胞源枯竭所致。目前治療宮腔粘連的方法如宮腔鏡下分離粘連組織、人工周期促內膜生長、放置宮腔屏障支架等均不能促使已經損傷枯竭的子宮內膜基底層干細胞再生。人早孕蛻膜間充質干細胞具有自我更新、多項分化能力等特征，可作為治療IUA的種子細胞。本課題組前期研究發現具有干細胞特性的人早孕蛻膜間充質干細胞(human decidual mesenchymal stem cells, hDMSCs)在生理狀態下參與修復受損的子宮內膜，并可在體外誘導分化為子宮內膜組織[2]。本研究擬通過建立IUA動物模型，探討hDMSCs修復子宮內膜的可行性和有效性，以期為治療IUA提供新方法。

材料和方法

1實驗材料

1.1實驗動物SPF級健康雌性SD大鼠40只，鼠齡8～10 周，體重200～230 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，飼養于暨南大學實驗動物管理中心SPF級動物房。飼養條件：5只/籠，自由進食水，室溫21 ℃～22 ℃，相對濕度(體積分數)40%～70%，噪音低于85 db，通風換氣每小時8～12次。

1.2hDMSCs標本來源實驗所用蛻膜標本取材于暨南大學附屬第一醫院婦產科門診首次妊娠需要行人工流產術的健康女性，孕期為45～60 d，年齡在20～28歲。既往無乙肝、梅毒等傳染性疾病，術前未服用米非司酮及其它藥物。經醫院倫理委員會批準和孕早期人工流產患者知情同意。在施行人流手術時無菌條件下刮取蛻膜組織，立即放入預冷的含有青霉素和鏈霉素的PBS緩沖液中，4 ℃保存。

1.3主要實驗試劑及儀器小鼠抗人波形蛋白(vimentin)單克隆抗體和小鼠抗人細胞角蛋白18(cytokeratin-18)單克隆抗體購自武漢博士德;兔抗鼠泛細胞角蛋白(pan-cytokeratin)單克隆抗體(Santa Cruz);兔抗鼠轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)多克隆抗體(沈陽萬類);兔抗鼠整合素αγβ3(integrin αγβ3)多克隆抗體(Affinity)；濃縮型SABC-CY3 (小鼠IgG)試劑盒(武漢博士德)；DAPI(Sigma)；CM-Dio綠色熒光探針(碧云天)；qPCR引物(上海生工)；熒光倒置相差顯微鏡(Zeiss)。

2實驗方法

2.1hDMSCs的分離和培養以膠原酶聯合機械研磨法分離提取hDMSCs[2〗。應用流式細胞儀檢測hDMSCs表面標志物CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD105和W5C5的表達。成骨成脂誘導分化檢測hDMSCs多向分化能力。細胞免疫組織化學法檢測hDMSCs波形蛋白和cytokeratin-18表達情況，鑒定其細胞來源。

2.2hDMSCs的CM-Dio標記取25 mg CM-Dio綠色熒光探針粉末溶于5 mL DMSO中，配置成CM-Dio標記液。取貼壁融合80%的細胞，以5 μL/mL的比例加入標記液，避光于培養箱中孵育30 min，吸棄標記液，更換3次新鮮37 ℃的完全培養基后繼續培養。

2.3實驗分組及hDMSCs移植將30只大鼠隨機分為3組，每組各10只：IUA+hDMSCs組、IUA組和sham組。麻醉大鼠后，常規消毒開腹，挑出雙側宮角，用止血鉗夾閉宮角兩端，于近卵巢端以4.5號注射器針頭將預溫至100 ℃的無菌生理鹽水注射至宮腔，使宮腔充分膨脹10 s。松開遠端止血鉗，再以冷的生理鹽水沖洗宮腔，關腹。造模成功后10 min內，IUA+hDMSCs組行尾靜脈注射2×106個Dio-hDMSCs細胞懸液，此后每隔3天補充1次，連續3次；IUA組行尾靜脈注射相同容量的PBS；sham組行開腹手術。

2.4hDMSCs移植后評價hDMSCs移植3個動情周期后處死，行大體觀察, 收集雙側子宮組織，部分至于-80 ℃保存。取雙側子宮石蠟包埋, 作子宮橫斷面切片，行HE染色、Masson染色和免疫組化染色，每張切片隨機選擇5個高倍視野進行拍照。以Image-Pro Plus 6.0軟件對照片進行數據測量：HE染色切片測量各組子宮內膜厚度、子宮內膜小血管數目及子宮內膜腺體數目，取其平均值；Masson染色切片可見藍綠色子宮內膜間質膠原纖維，測量子宮內膜纖維化面積與子宮內膜間質總面積的比值，取平均值；同時取子宮中段橫切面作冰凍切片，熒光顯微鏡觀察移植Dio-hDMSCs在大鼠子宮的存活及分布情況。

2.5免疫組化半定量評估免疫組織化學法行pan-cytokeratin、vimentin、TGF-β1和integrin αγβ3染色，觀察范圍為包括子宮內膜間質層和上皮層在內的子宮內膜全層，染色陽性為棕黃色顆粒。參考文獻[3]方法，在HSI模式下，測定每高倍視野選定某區域的總面積(area)、陽性產物的總積分吸光度值(integrated absorbance,IA)，計算該區域中陽性顆粒的平均光密度值(mean density, MD)，公式為MD=IA/area，每個視野選取5個區域，取平均值。

2.6宮腔粘連相關mRNA表達水平檢測將宮腔組織在液氮中進行研磨，提取總RNA；按反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄，采用熒光定量PCR(quantitive PCR, qPCR)測定相關因子如: 干細胞因子(stem cell factor,SCF)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、血小板反應蛋白-1(thrombospondin-1,TSP-1)、結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)和胰島素生長因子-1(insulin-like growth factors-1,IGF-1) 等mRNA的含量，反應體系為：反轉錄產物2.5 μL，7.5 μmol/L的上、下游基因引物各2.0 μL，qPCR Mix 12.5 μL，加8.0 μL的H2O。PCR擴增條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個循環。qPCR采用2-ΔΔCt法統計分析結果。引物序列如表1。

2.7生育力評估取10只雌鼠行右側宮腔造模，造模后隨機分為IUA+hDMSCs組(尾靜脈注射hDMSCs，n=5)和IUA組(尾靜脈注射PBS，n=5)2組，每只大鼠的左側宮腔設為自身對照(n=10)。3個動情周期后雌鼠與雄性SD大鼠3∶1合籠，合籠當日記為孕0.5 d，合籠3 d后分離雌雄鼠，單獨飼養孕鼠13 d后處死，觀察各組大鼠受孕情況和各組胎鼠的數量。

3統計學處理

使用SPSS 16.0進行統計學分析。計量資料采用均數±標準差(mean±SD)表示，兩組間比較采用配對t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1hDMSCs的細胞形態及鑒定

hDMSCs形態呈短桿狀或長梭狀(圖1)。流式細胞術檢測結果顯示，hDMSCs不表達造血干細胞表面標志物 CD34和CD45，強表達 CD29、CD44、CD73和CD105，部分表達W5C5(圖2)。hDMSCs可向成骨、成脂方向分化。免疫組化檢測hDMSCs表達vimentin，不表達cytokeratin。

Figure 1.The cellular morphology of hDMSCs(×100).

圖1 hDMSCs的細胞形態

2各組大鼠子宮大體及組織病理學結果比較

術后各組大鼠均健康活躍，IUA組大體可見子宮形態萎縮硬化，部分子宮上段積水，被大網膜或腸管包裹；HE染色可見宮腔縮窄，子宮內膜腺體減少，部分宮腔閉鎖，無正常皺褶結構；Masson染色顯示間質組織大量纖維化，符合宮腔粘連病理改變。IUA+hDMSCs組可見子宮與周圍組織粘連減輕，HE和Masson染色見子宮內膜較IUA組有大量新生基質細胞和上皮細胞，肌層結構有序，間質層纖維化減輕，厚度近似正常組織，間質內大量新生腺體，與sham組相似，見圖3。

Figure 2.The flow cytometry results of hDMSCs.

圖2hDMSCs的流式細胞結果

Figure 3.The histopathological examination of endometrium in each group (Masson staining,×40). A: IUA group; B： sham group; C: IUA+hDMSCs group.

圖3各組大鼠子宮組織病理學檢查結果

3各組大鼠子宮內膜厚度、子宮內膜腺體數量、子宮內膜小血管數量及子宮內膜纖維化程度比較

IUA+hDMSCs組大鼠子宮內膜厚度為(650.33±170.99) μm，略低于sham組， IUA組的子宮內膜厚度為(363.51±235.17) μm，IUA+hDMSCs組及sham組與IUA組的子宮內膜厚度比較有統計學差異(P<0.05)。IUA+hDMSCs組大鼠子宮內膜腺體個數為3.42±0.88，IUA+hDMSCs組與sham組的子宮內膜腺體數量比較無統計學差異，均高于IUA組(P<0.05)。IUA+hDMSCs組大鼠子宮內膜小血管數目為21.90±6.32，近似sham組，前二者均多于IUA組(P<0.05)。IUA+hDMSCs組子宮內膜纖維化面積比率與sham組比較無統計學差異，二者均小于IUA組(P<0.05)，見表2。

*P<0.05vsIUA.

4熒光顯微鏡下移植細胞在大鼠子宮中的存活及分布

hDMSCs移植3個動情周期后，處死動物，橫向包埋并沿長軸切取子宮組織，DAPI染核，制作冰凍切片，于熒光顯微鏡下觀察。子宮中可見綠色熒光hDMSCs，主要分布于子宮腔上皮層，見圖4。

Figure 4.CM-Dio labeled hDMSCs in endometrium (immunofluorescence staining,×400).

圖4CM-Dio標記hDMSCs在大鼠子宮中的存活及分布

5各組免疫組化4種蛋白水平表達結果比較

Cytokeratin免疫組化結果顯示：IUA+hDMSCs組可見大量棕黃色顆粒沉積于柱狀上皮細胞胞漿中；IUA組子宮內膜雜亂，棕黃色顆粒沉積于上皮細胞胞漿中，分布不均勻。Vimentin免疫組化結果顯示：IUA+hDMSCs組可見棕黃色顆粒沉積于基質細胞和內皮細胞中，腺上皮細胞中未見沉積；IUA組見淡棕黃色顆粒分布于間質中。TGF-β1免疫組化結果顯示：IUA+hDMSCs組可見棕黃色顆粒沉積于上皮細胞中，IUA組見大量棕黃色顆粒分布于上皮細胞和間質細胞中。Integrin αγβ3免疫組化結果顯示：IUA+hDMSCs組integrin αγβ3主要沉積于上皮細胞中，間質中亦有少量分布；而IUA組中見少量棕黃色顆粒散布于上皮細胞中。IUA+hDMSCs組cytokeratin、vimentin和integrin αγβ3的表達量顯著高于IUA組(P<0.05)，但仍不及sham組，而IUA組TGF-β1表達量均高于IUA+hDMSCs組及IUA組(P<0.05)，見表3。

6宮腔粘連相關mRNA表達水平檢測

qPCR結果顯示，與IUA組相比，除TNF-α、CTGF下調外，IUA+hDMSCs組的SCF、VEGF、bFGF和TSP-1均明顯上調(P<0.05)，見圖5。

#P<0.05vsIUA；*P<0.05vssham.

Figure 5.Relative mRNA expression. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsIUA.

圖5宮腔粘連mRNA表達水平檢測

7生育力實驗評估

處死孕16.5 d的大鼠，開腹分離子宮，觀察各組孕鼠的數量和每側子宮胎鼠個數。IUA+hDMSCs組和IUA組的左側宮腔均有胎鼠，且胎鼠數量差異無統計學意義。IUA+hDMSCs組右側宮腔均妊娠(n=5)，IUA組右側宮腔妊娠孕鼠數為4只，平均胎鼠數量分別為(6±1)只和(1±1)只，差異有統計學意義(P<0.05)。

討論

子宮內膜是高度再生的組織，其再生基礎是基底層完整。創傷、感染等因素損傷子宮內膜基底層，使基底層部分或完全缺失，喪失周期性功能修復，進而啟動纖維性修復導致IUA[1]。目前宮腔鏡下粘連分離術是診療IUA的金標準，但此法不適用于致密的中、重度IUA，且術后粘連復發率高，尤其對于重度粘連的復發率可達60%[1]。而宮腔支撐物、防粘連生物材料、應用雌激素等方法雖然能在一定程度上預防粘連的復發，但無法促進受損的基底層再生[4]。隨著干細胞治療相關基礎理論與臨床應用研究的進展，干細胞應用對于此類難治性宮腔粘連具有不可估量的治療前景[5]。再生醫學修復子宮內膜的候選細胞有骨髓間充質干細胞、脂肪間充質干細胞、胚胎干細胞以及口腔上皮細胞等[6]。目前已有將自體干細胞移植至重度宮腔粘連患者體內，作為替代療法后行IVF-ET使患者成功受孕的報道[7]，提示自體干細胞可用于治療IUA 等子宮內膜修復障礙性疾病。

本研究采用的蛻膜間充質干細胞在胎盤胎膜發育過程中可分泌多種蛋白，并隨著孕周增大與絨毛膜細胞共同發育為胎盤，具有強大的增殖能力[8]。本研究采用膠原酶和機械研磨法分離出hDMSCs，流式細胞檢測可表達間充質干細胞表面標志物CD29、CD44、CD73和CD105，不表達造血干細胞表面標志物CD34和CD45。W5C5是子宮內膜間充質干細胞特異性的表面抗原，該抗原陽性的細胞相比陰性細胞集落形成能力強，能在體內分化成子宮內膜基質細胞[9]。本研究分離的hDMSCs表面抗原W5C5陽性細胞約為25.23%，提示該類hDMSCs來源于子宮內膜，亦可能具有以上能力，可進一步使用磁珠分選法進行驗證。細胞免疫組化結果顯示其表達波形蛋白，而不表達角蛋白，進一步提示其來源于子宮內膜。

本研究模擬子宮內膜消融術，采用熱水灌注在高溫的作用下持續損傷子宮內膜，使組織細胞蛋白凝固壞死，大量上皮細胞脫落于宮腔，以致間質甚至肌層組織裸露，進而產生一系列炎癥反應。在內膜修復過程中間質結締組織異常增生、纖維化，纖維化的間質組織由于缺乏腔上皮的保護作用而相互粘連[10]，從而模擬宮腔粘連。在此條件下，將hDMSCs移植入宮腔粘連模型大鼠體內，3個動情周后觀察到IUA+hDMSCs組大鼠子宮與周圍組織粘連減輕，形態恢復。HE染色見子宮內膜間質厚度增加，上皮組織覆蓋，較IUA組大鼠子宮內膜明顯增厚，且小血管數量和腺體數量明顯增加。同時hDMSCs通過分泌VEGF促進子宮內膜小血管再生，IGF-1促進上皮細胞和基質細胞再生,逆轉IUA無血管化，促進腺體再生。免疫組化結果顯示IUA+hDMSCs組vimentin和cytokeratin兩種子宮內膜標志蛋白表達量均比IUA組高，SCF上調亦證實了hDMSCs促進子宮內膜細胞增生，修復損傷的子宮內膜組織。

TGF-β與多種器官組織的纖維化密切相關，在IUA的發生發展過程中起著重要作用。研究表明IUA患者的子宮內膜組織中TGF-β表達升高，其表達水平與IUA嚴重程度呈正相關性[11]。其中TGF-β1是TGF-β家族中比例最大、活性最強的一個亞型，其持續高濃度狀態是子宮內膜損傷修復過程中纖維化的主要原因[12]。本研究中免疫組化結果顯示IUA+hDMSCs組TGF-β1表達比IUA組低，提示hDMSCs可能通過下調TGF-β1起抗纖維化作用。研究表明TSP-1有活化TGF-β1、抑制血管新生的作用[13]，但本研究中TSP-1上調，可能作為一種調控免疫反應的補償機制，使組織免受過度損傷[14]。

治療IUA的目的不僅是促進受損的子宮內膜修復，恢復正常月經周期，逆轉纖維化，其最重要的目的是改善患者的生育能力。子宮內膜容受性是子宮內膜允許胚胎著床的重要指標，integrin αγβ3是子宮內膜容受性的標志物之一，在維持胚胎著床和發育中起重要作用。IUA患者integrin αγβ3表達異常，子宮內膜容受性降低，影響囊胚著床，進而導致不孕或流產[15]。本研究中IUA+hDMSCs組integrin αγβ3表達高于IUA組，生育力評估中也驗證hDMSCs治療能提高子宮內膜容受性，穩定囊胚定位、黏附、著床。綜上所述，hDMSCs通過分泌相關因子減輕子宮內膜纖維化程度，同時補充枯竭的基底層細胞，增加integrin αγβ3提高子宮內膜容受性，從形態上、功能上參與受損子宮內膜的修復。

熱水灌注法建立的宮腔粘連模型并不能確切模擬臨床所致的IUA是本研究的不足之處?？紤]目前現有研究建立的幾乎均為非妊娠期子宮損傷模型[16]，本課題組將進一步改善IUA模型，建立貼近臨床實際的妊娠子宮損傷模型，從不同移植途徑、體內示蹤和分化潛能探索hDMSCs修復子宮內膜的具體作用機制。

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(責任編輯： 林白霜， 羅森)

Therapeutic effect of first-trimester human decidual mesenchymal stem cell transplantation on intrauterine adhesions in rats

LIN Xin-zi, HUANG Chen-ling-zi, LUO Xin, SHUAI Han-lin

(DepartmentofObstetricsandGynecology,TheFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tluox@126.com;piaoshuai2003@163.com)

[KEY WORDS]First-trimester human decidual mesenchymal stem cells; Intrauterine adhesions; Rats

[ABSTRACT]AIM: To investigate the feasibility and therapeutic effect of transplantation with first-trimester human decidual mesenchymal stem cells (hDMSCs) on intrauterine adhesions (IUA) in rats. METHODS: The hDMSCs were isolated, cultured, purified and identifiedinvitro. Female SD rats were randomly divided into IUA+hDMSCs group, IUA group and sham group. The rats in IUA group were injected with 1 mL PBS via the tail vein, while the rats in IUA+hDMSCs group were injected with 2×106hDMSCs with 3 consecutive injections at every 3-day intervals. The rats in sham group only received laparotomy. The general, histological, and immunohistochemical observations were performed 3 estrous cycles postoperatively. The expression of IUA-related genes was analyzed by quantitative PCR. Immunofluorescence and pregnancy test were also performed. RESULTS: The modeled uteri were of partial atresia and fibrosis, the endometrium was atrophic and the numbers of gland decreased. The endometrium was significantly thicker, the numbers of gland and small vessels increased, and the fibrosis decreased in IUA+hDMSCs group compared with IUA group (P<0.05). The expression of cytokeratin, vimentin and integrin αγβ3 was significantly stronger in IUA+hDMSCs group than that in IUA group, whereas the expression of TGF-β1 was weaker than that in IUA group (P<0.05). The average number of litters in right horns of IUA+hDMSCs group was more than that in IUA group (P<0.05). Except for down-regulation of TNF-α and CTGF, compared with IUA group, the mRNA expression levels of SCF, VEGF, bFGF, IGF-1 and TSP-1 were increased in IUA+hDMSCs group. Dio-labeled hDMSCs mainly located in endometrial epithelium.CONCLUSION: The first-trimester human decidual mesenchymal stem cells survive and proliferate in the rat endometrium and regenerate the endometrium. hDMSC transplantation is a potential novel treatment for IUA and may also be useful to prevent IUA after uterine injury.

[文章編號]1000- 4718(2016)06- 1099- 07

[收稿日期]2015- 11- 17[修回日期] 2016- 04- 25

*[基金項目]浙江省科技廳科技計劃重大科技專項重大社會發展項目(No. 2012C13015-2)

通訊作者△羅新 Tel: 020-38688857； E-mail： tluox@126.com； 帥翰林 Tel： 020-38688769； E-mail： piaoshuai2003@163.com

[中圖分類號]R363； R711.74

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.023