TRAF3抑制NF-κB引起的腎囊腔形成作用*

孫麗萍，　胡巢鳳，　張欣洲△

(1暨南大學第二臨床醫學院深圳市人民醫院腎內科，廣東 深圳 518020;2暨南大學醫學院病理生理學教研室，廣東 廣州 510632)

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TRAF3抑制NF-κB引起的腎囊腔形成作用*

孫麗萍1，胡巢鳳2，張欣洲1△

(1暨南大學第二臨床醫學院深圳市人民醫院腎內科，廣東 深圳 518020;2暨南大學醫學院病理生理學教研室，廣東 廣州 510632)

[摘要]目的： 研究腫瘤壞死因子受體相關因子3(TRAF3)對多囊腎集合管上皮細胞中核因子κB(NF-κB)信號通路及其下游產物表達的影響；觀察TRAF3基因過表達的多囊腎集合管上皮細胞形成管狀分支結構的變化，探討TRAF3在多囊腎囊腔形成的發生發展中可能產生的作用。方法: Western blot檢測多囊腎集合管上皮細胞和TRAF3基因過表達多囊腎集合管上皮細胞中NF-κB信號通路的變化，同時檢測下游凋亡因子Bax 及 Bid 的表達及caspase-3 活性變化；通過Annexin V-FITC/PI雙染法檢測各組細胞的凋亡情況；應用三維(3D)培養法觀察多囊腎集合管上皮細胞形成管狀分支結構變化的差異。結果: TRAF3的過表達能顯著抑制多囊腎集合管上皮細胞中 NF-κB 信號通路的活性，使下游的Bax及Bid表達顯著下調，細胞凋亡明顯減少；TRAF3 基因過表達多囊腎集合管上皮細胞管狀分支結構較多囊腎集合管上皮細胞組明顯增多。結論: TRAF3可能通過調節NF-κB 信號通路降低Bax及Bid活性，抑制細胞凋亡，從而抑制多囊腎囊腔形成。

[關鍵詞]腫瘤壞死因子受體相關因子3; 核因子κB; 細胞凋亡; 囊腔形成,腎

多囊腎(polycystic kidney disease，PKD)是一種常見的常染色體遺傳病，為單基因遺傳，遺傳學上將其分為顯性和隱性2大類，兩種類型均造成雙側腎臟發生病變。其中常染色體顯性遺傳性多囊腎病(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)最常見，主要特點為腎小管上皮細胞來源的充滿液體的囊泡不斷地形成和擴張，且典型病例在中年時期會發展到終末期腎臟疾病(end-stage renal disease，ESRD)階段，5%～10%使用腎臟替代治療的 終末期腎臟病患者均由 ADPKD 引起[1]。常染色體隱性遺傳性多囊腎病(autosomal recessive polycystic kidney disease，ARPKD)是一種多發于嬰幼兒的遺傳性疾病，全球發病率約為1/20 000[2]。ADPKD 多于成年后發病，發病率高(約為 1/400～1/1 000)且預后不良，目前臨床上尚無有效治療方法。因此，深入了解多囊腎病的發病機理，揭示其發生發展中的分子機制，針對致病基因發病機理進行干預，并探討有效的早期診斷標志物及藥物治療靶點，具有重要意義。

腫瘤壞死因子受體相關因子(tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF)家族是一類重要的胞內接頭蛋白，能直接或間接與胞漿內的其它信號分子結合，從而參與多種下游信號通路的信號轉導，進而調節細胞增殖、存活、凋亡[3]。目前已發現7種不同的TRAF蛋白，TRAF3就是其中的一員。TRAF3廣泛存在于體內的各個組織，是核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)非經典通路重要的銜接蛋白。有研究發現[4-5]，TRAF3表達下調可抑制 腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)引起的 NF-κB p100 的聚集并激活IKK復合物，引起NIK表達增加。我們前期研究發現[6-7]，在多囊腎肝病1(polycystic kidney and hepatic disease 1，Pkhd1)基因部分沉默的內髓集合管細胞 (inner medullary collecting duct, IMCD)中，NF-κB處于持續性激活狀態，并可導致細胞凋亡增加，并發現NF-κB促進三維(3D)培養的腎小管管腔增大，囊腔形成。因此，TRAF3 可能通過調節NF-κB通路，參與ARPKD腎集合管上皮細胞抗凋亡作用。本研究旨在探討多囊腎細胞中 TRAF3 是否可以通過NF-κB信號通路抑制多囊腎囊腔形成。

材料和方法

1材料

1.1主要材料與試劑RPMI-1640 培養基、LHC-9 培養基、胎牛血清和青霉素鏈霉素雙抗溶液(HyClone)；EDTA-胰蛋白酶(Gibco)；DMSO (Sigma)；DBA 免疫組化試劑盒(ZYMED Laboratories Inc.)；BCA 蛋白濃度測定試劑盒(Pierce)；NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents kit (碧云天生物技術研究所)；Caspase-3 Activity Assay Kits(Calbiochem)；兔抗鼠 NF-κB (p65) 抗體試劑盒、HRP標記的羊抗兔II抗(Cell Signaling Technology)；兔抗鼠TRAF3多克隆抗體、兔抗鼠Bax單克隆抗體、兔抗鼠及Bid單克隆抗體(Santa Cruz)；小鼠內髓集合管細胞株購自中國科學院細胞庫；其它試劑均為 Fisher 產品。

1.2多囊腎小鼠模型的建立Pkhd1 基因第 15 和 16 外顯子敲除的C57BL/6小鼠模型由南華大學賀修勝教授饋贈。由于Pkhd1 基因缺失，該小鼠模型的肝和腎表現出不同程度的管道擴張、囊腫和纖維化，有部分小鼠在胚胎即死亡，絕大部分小鼠由于肝腎囊腫而僅能存活 1 年；除此之外，Pkhd1-/-小鼠的胰腺和腦組織也出現囊腫和小管擴張；這些癥狀很好地模擬了人類 ARPKD。文中我們將這一Pkhd1 基因突變小鼠模型稱為多囊腎小鼠。

1.3多囊腎集合管上皮細胞的分離及擴增培養將8周齡多囊腎小鼠乙醚麻醉，75%乙醇浸泡10 min；無菌條件下，打開腹腔，迅速取出腎臟，置于10 mL預冷的PBS(含5 mmol/L蔗糖)中，冰浴。用刀片切碎腎臟。用10 mL 0.5%膠原酶將其轉移至10 mL離心管中，用吸管吹散混勻；在37 ℃條件下消化40 min，將消化后的組織液用70 μm孔徑濾篩網過濾去除未被消化的結締組織；過濾后室溫1 000 r/min離心10 min。棄去上清后加入10 mL的PBS(含5 mmol/L蔗糖)，混勻，室溫1 000 r/min離心5 min,重復用PBS洗滌1次。棄去上清，加入含DBA抗體(終濃度10 μmol/L)的PBS(含5 mmol/L蔗糖)10 mL，4 ℃反應1 h，1 000 r/min離心5 min，用PBS(含5 mmol/L蔗糖)洗滌2次，完全棄去上清。將含有磁珠的1 mL PBS(含5 mmol/L蔗糖，可結合的最大細胞數為2×107)重懸后，轉移至已棄去上清的含有細胞沉淀的離心管中，充分混勻，4 ℃反應30 min。置于磁柱上吸附5 min，吸掉液體，加入5 mL PBS(含5 mmol/L蔗糖)，小心混勻，洗滌2次。棄去上清，加入含5 μL release buffer的無血清RPMI-1640 培養基 400 μL，混勻后37 ℃孵育20 min。置于磁柱上吸附5 min，將上清轉移至15 mL離心管中，加入RPMI-1640 培養基洗滌2次，室溫 1 000 r/min 離心 5 min。棄去上清，加入適量含5%胎牛血清的RPMI-1640 培養基混勻，加入24 孔板中(24孔板事先加入0.1%明膠包被，室溫放置 30 min 以上)，37 ℃培養箱中培養 48 h。待細胞貼壁后，將培養基換成含 γ-干擾素 的 LHC-9 培養基，33 ℃繼續培養。所有實驗用細胞都需轉移至 37 ℃培養箱中培養 3 d后再進行實驗研究。

2方法

2.1細胞培養小鼠多囊腎集合管上皮細胞和小鼠IMCD 細胞株均用含 10% 胎牛血清、1% 雙抗的 RPMI-1640 培養基進行培養。3～4 d 細胞長到 90%左右融合時，PBS 緩沖液清洗，用胰酶消化，離心收集細胞，細胞計數儀計數后細胞按每孔 1×106個接種于 6 孔板。IMCD細胞是內髓集合管細胞，我們前期利用 RNAi 特異性抑制 Pkhd1 在 IMCD 細胞內的表達后發現，NF-κB處于持續性激活狀態，并可導致細胞凋亡增加， IMCD 細胞不能在 3D培養條件形成管狀分支結構，文中用此細胞作為從多囊腎小鼠腎臟提取的細胞的對照細胞。

2.2TRAF3基因轉染構建pCDNA3.0-hTRAF3質粒，用 pCDNA 空載體質粒作為對照質粒，用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 對細胞進行轉染，按照試劑盒說明書進行操作。提取蛋白 用Western blot檢測TRAF3的表達效率。

2.3細胞核蛋白提取按NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents Kit試劑盒說明書加入核蛋白抽提試劑提取細胞中核蛋白，終濃度調整為2 g/L。細胞培養至80%～90%融合，棄培養液，加3 mL預冷 PBS 漂洗細胞2次，棄漂洗液，取1.5 mL胞漿蛋白裂解液I漂洗細胞1次，棄漂洗液，取1.0 mL胞漿蛋白裂解液H于培養瓶中溶解細胞，吸凈裂解液，轉入1.5 mL離心管中，4 ℃、14 000 r/min離心2 min，分離上清，取0.5 mL胞漿蛋白裂解液I漂洗沉淀 1 次，4 ℃、14 000 r/inm離心2 min，取50 μL核裂解液重懸沉淀，4 ℃靜置30 min，棄上清，4 ℃、14 000 r/min離心20 min，取上清液(即核抽提物)于-80 ℃保存。

2.4HE染色取材標本放置于 4%多聚甲醛中固定 18～24 h，脫水石蠟包埋，制成石蠟標本，4 μm 切片，每 1 例均連續切片，用于 HE 染色和免疫組織化學染色。組織片置于二甲苯中浸泡 15 min，更換二甲苯后再浸泡 2 min，在 100%、95%、90%、85%的乙醇中依次浸泡 3 min，流動自來水清洗 2 min，用蘇木素染色 5 min，流動自來水沖洗 5 min，鹽酸乙醇分化 2 min，自來水沖洗 5 min，70%乙醇浸泡 2 min，伊紅染色 1 min，將載玻片依次放入 95%乙醇-100%乙醇×二甲苯II，各2 min，通風櫥室溫晾干，細胞核染成藍色,細胞質為紅色。光學顯微鏡觀察、拍照。

2.5Western blot檢測蛋白水平當細胞融合度為 80%～90%時，用RIPA裂解液冰上裂解 30 min，4 ℃、 12 000 r/min 離心 15 min，取上清液用BCA 法上酶標儀測定蛋白濃度；上樣20 μg蛋白，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，100 ℃加熱5 min，使蛋白變性；30 mA 恒流行 7%～15% SDS-PAGE 分離樣本，以 100 V 恒壓轉移到 PVDF 膜上，用 5% 脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h，分別加入兔抗鼠TRAF3(1∶800)、抗NF-κB(p65)、抗Bid(1∶1 000)及抗Bax抗體 (1∶1 000)室溫孵育 2 h，次日用 TBST 漂洗 3次后加入 HRP 標記的II抗 (1∶5 000)室溫孵育 1 h，TBST 清洗3 次加入 ECL 顯色；通過凝膠成像系統掃描分析各蛋白變化。以β-actin 作為內參照。

2.6細胞免疫熒光染色4%多聚甲醛固定細胞，置于 4 ℃ 30 min；PBS 洗3遍后，用1% BSA+0.3% Triton X-100 室溫透化 1 h。1 % BSA 溶液室溫封閉2 h，加入適量 I 抗稀釋液(1 % BSA 溶液)配制 I 抗，4 ℃反應過夜。PBS洗3次，加入Cy2/Cy3 標記 II 抗(1∶1 000 稀釋于 1% BSA/PBS 中)，避光室溫反應 1 h，PBS 洗3 次，加入DAPI (1∶10 000 稀釋于 PBS 中)室溫反應 30 s；PBS 洗3 次。用封片劑 Aqueous Mountant 封片，蓋玻片周圍用指甲油密封。封片后熒光顯微鏡下進行觀察或保存于 4 ℃后續觀察。

2.7流式細胞術檢測細胞凋亡取對數生長期的各組細胞，調節細胞濃度為1×108/L，接種于6孔培養板內；細胞長至80%融合時，無血清饑餓24 h誘導細胞凋亡；收集細胞，PBS緩沖液洗滌；重懸細胞于0.5 mL binding buffer中，加入2 μL Annexin V-EGFP 和5 μL 碘化丙啶(propidium iodide, PI)，混勻后室溫避光反應10 min，應用Single histogram statistic分析軟件測定細胞凋亡率。

2.8Caspase-3的活性檢測按照Calbiochem的Caspase-3 Activity Assay Kits 操作說明，離心收集細胞，使用預冷的PBS洗滌細胞2次，加裂解緩沖液重懸細胞，冰上孵育20 min，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清進行蛋白含量測定；加入反應試劑，與caspase-3的底物(Nacetyl-Asp-Glu-Val-Asp-p-nitroanilide)在37 ℃孵育4 h； 405 nm處測定吸光度(A)值。

2.93D細胞培養待細胞長至90%融合時，0.25%胰酶消化細胞，并用無血清1×RPMl-1640培養基清洗1遍。按下列比例配置膠原基質膠：375 μL H2O，100 μL 200 mmol/L HEPES，10×RPMI-1640 100 μL，50 μL 74 g/L NaHCO3，375 μL rat type I collagen，25 μL Matrigen，1滴 NaOH(pH7.4)，5 μL內含3×106細胞的細胞液，混勻。96孔板每孔加入 100 μL 混有細胞的膠原基質膠，實驗設置3個復孔。剩余的細胞再加入等體積的膠原基質膠使細胞濃度減半，再按3個復孔種于96孔板。置 37 ℃培養箱培養1h，待膠凝固后加入100 μL 培養基 (10%胎牛血清+1×RPMI-1640)。37 ℃培養箱培養 7 d后，顯微鏡下觀察。

3統計學處理

所有實驗均至少重復3次，各實驗組數據采用SPSS 16.0統計軟件處理。數據用均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較用單因素方差分析，并用 SNK-q檢驗進行各組之間的兩兩比較，以P<0.05 為差異有統計學意義。

結果

1常染色體隱性遺傳性多囊腎小鼠模型的鑒定

為了確定多囊腎小鼠模型作為腎囊腫研究的可行性，本實驗收取從胚胎時期到出生后不同時期小鼠腎臟(胚胎15.5 d、18.5 d，出生后5 d、10 d)，HE染色觀察從胚胎時期到小鼠死亡不同時期腎臟囊性結構發展過程。結果發現多囊腎小鼠腎臟囊腫在胚胎15.5 d時已經出現囊性結構，隨著時間的延長，胚胎18.5 d時，在髓質區囊性結構變大；出生后5 d，腎臟囊性結構進一步發生融合,變大；出生后10 d，腎臟大部分區域發生囊性化，皮質變薄，可見融合的囊性結構,見圖1。

2多囊腎集合管上皮細胞中NF-κB的表達

從8周齡多囊腎小鼠中取出腎臟，通過應用雙花扁豆凝集素(Dolichus biflorus agglutinin，DBA)分離方法，獲得的多囊腎集合管上皮細胞系。DBA作為集合管細胞標志物[8]，并用E-cadherin作為上皮細胞標準物[9]，以鑒定細胞原始來源。免疫熒光染色顯示本實驗原代分離的細胞表達集合管細胞標志物DBA和上皮細胞標準物 E-cadherin。結果表明，我們已成功建立多囊腎集合管上皮細胞，見圖2。

Figure 1.The changes of renal cysts in a mouse model of ARPKD in different periods under microscope.E：embryonic；P：postnatal (×10).

圖1不同時期10倍鏡下多囊腎小鼠腎臟囊腫的變化

Figure 2.The characteristics of collecting duct cell lines derived from the kidneys of mouse model of ARPKD. The cell lines were characterized by staining with collecting duct cell marker Dolichos biflorus agglutinin and epithelial cell markers E-cadherin. The scale bar=5 μm.

圖2多囊腎小鼠腎臟集合管上皮細胞的特征

細胞鑒定成功后，在培養的細胞中加入TNF-α(質量濃度 50 μg/L)分別作用15 min和30 min后收取蛋白，Western blot檢測細胞核NF-κB (p65)蛋白的表達情況，結果顯示刺激15 min 時點多囊腎集合管上皮細胞組胞核 NF-κB (p65)蛋白表達水平明顯高于IMCD組(P<0.05)，30 min 時點胞核NF-κB(p65)表達水平與IMCD組比較也明顯升高(P<0.05)，且與15 min時點相當,見圖 3。

3TRAF3 對 NF-κB 信號通路及Bax、Bid的作用

TRAF3基因過表達多囊腎集合管上皮細胞組(實驗組)TRAF3表達顯著增高。TNF-α 刺激15 min后，實驗組細胞核NF-κB(p65)及細胞中Bax、Bid的表達較多囊腎集合管上皮細胞組(對照組)明顯下降(P<0.05)，而兩組內Bax及Bid 的表達水平差異無統計學顯著性。表明TRAF3 對NF-κB信號通路激活的抑制可以進一步影響下游凋亡因子的表達，見圖4。

Figure 3.The expression of NF-κB (p65) in the ARPKD renal collecting duct epithelial cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsIMCD group.

圖3多囊腎集合管上皮細胞中NF-κB(p65)的表達

4TRAF3對細胞凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡的實驗結果顯示，相對于IMCD組細胞，多囊腎集合管上皮細胞組中的細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)；與多囊腎集合管上皮細胞組相比，過表達TRAF3的多囊腎集合管上皮細胞組細胞凋亡率明顯減少(P<0.05)。

我們檢測了caspase-3的酶活性，進而驗證細胞凋亡中caspase-3活性的變化。結果發現，與IMCD組相比，多囊腎集合管上皮細胞組的caspase-3活性顯著增加(P<0.05),而過表達TRAF3的多囊腎集合管上皮細胞組caspase-3活性則較多囊腎集合管上皮細胞顯著降低。結果和Annexin V-FITC/PI雙染的流式細胞術檢測結果一致,見圖5。

Figure 4.The activation of NF-κB signaling pathway in TRAF3 over-expressed cells. Control group was ARPKD renal collecting duct epithelial cells, experiment group was TRAF3 over-expressed ARPKD renal collecting duct epithelial cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4TRAF3 過表達細胞中NF-κB信號通路激活情況

5TRAF3對3D培養條件下管狀分支結構形成的影響

在膠原/基質膠三維培養條件下，80% IMCD細胞能形成腎內小管樣分支結構；與此相反，約95%的多囊腎集合管上皮細胞管狀分支的形成顯著降低，而形成囊樣結構，不能形成管狀分支結構。接近60%的TRAF3過表達多囊腎集合管上皮細胞組能形成4個及其以上的分支，約 35%的細胞能形成1～3個分支，僅不足5%的細胞不能形成分支結構，見圖6。

Figure 5.The apoptosis was analyzed in the cells of TRAF3 over-expressed ARPKD renal collecting duct epithelial cells. A: the apoptosis was determined by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI double staining; B: the caspase-3 activity was measured. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsIMCD and TRAF3+PKD collecting duct epithelial cells.

圖5TRAF3過表達對細胞凋亡的影響

Figure 6.Tubulomorphogenesis was inducted in 3D culture of TRAF3 over-expressed PKD renal collecting duct epithelial cells. The scale bar=20 μm. A: IMCD cell; B: PKD renal collecting duct epithelial cell; C: TRAF3 over-expressed PKD renal collecting duct epithelial cell; D: cell tubulomorphogenesis counting. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsIMCD group.

圖6TRAF3過表達能促進多囊腎集合管上皮細胞形成管狀分支結構

討論

本研究通過對多囊腎集合管上皮細胞進行 TNF-α 刺激后檢測 NF-κB 信號通路的變化，證實NF-κB信號通路在多囊腎中起一定作用，進一步檢測過表達TRAF3 多囊腎集合管上皮細胞后 NF-κB 活性及其下游凋亡因子 Bax 及 Bid表達的變化，同時觀察了細胞凋亡情況，并觀察多囊腎集合管上皮細胞形成管狀分支結構的變化。證實了過表達 TRAF3 可以下調下游凋亡因子的表達，抑制細胞凋亡，進而使多囊腎集合管上皮細胞形成管狀分支結構。

多囊腎的發生是由人類腎臟小管生長發育分子失調所造成，因此揭示多囊腎發病機制，將有助于揭示腎臟小管發生、發育的分子機制[10]。我們前期研究證實了NF-κB 在FPC 缺陷細胞中處于持續性激活狀態。而最近研究發現抑制TRAF3的表達引起經典和非經典NF-κB的共同激活。因此我們推測TRAF3可能通過調節NF-κB信號通路抑制下游凋亡因子的活性，從而參與腎囊腫形成過程。本研究將TRAF3基因轉染多囊腎集合管上皮細胞使其過表達，發現相對于轉染空載體質粒的對照組，TNF-α激活的 NF-κB通路中的Bax及Bid的表達水平明顯下降，證明過表達TRAF3之后，多囊腎集合管上皮細胞中凋亡通路的激活受到抑制，使細胞凋亡減少。本研究結果顯示：過表達TRAF3 細胞中TNF-α刺激的下游抗凋亡因子Bax及Bid表達量顯著低于對照組，由此可知，TRAF3 在多囊腎集合管上皮細胞中可抑制NF-κB通路以及下游凋亡因子的激活與表達。

多項研究表明，小鼠腎集合管上皮細胞，在膠原/基質膠三維培養條件下能形成腎內小管樣分支結構[11]。ADPKD 的致病基因(PKD1 和PKD2)缺失能抑制在三維培養條件下形成管狀分支結構[12]；而高表達PKD1能促進MDCK細胞管狀分支結構形成[13]；我們前期利用 RNAi 特異性抑制Pkhd1在IMCD細胞內的表達后發現，IMCD3 細胞不能在 3D培養條件形成管狀分支結構。本研究發現，體外培養的TRAF3過表達多囊腎集合管上皮細胞組形成管狀分支結構較多囊腎集合管上皮細胞管狀分支的形成明顯增多。證明 TRAF3 過表達多囊腎集合管上皮細胞中，囊腔形成明顯減少。

綜上所述，在多囊腎集合管上皮細胞中，TRAF3可顯著抑制NF-κB信號通路以及下游凋亡因子表達。作為NF-κB 信號通路的一個負調控因子，TRAF3對于NF-κB引起的囊腔擴大具有抑制作用，可能成為多囊腎病中預防與保護腎小管結構破壞的潛在靶點。

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(責任編輯： 盧萍， 余小慧)

Effects of TRAF3 on inhibiting cyst formation induced by NF-κB signaling in kidney

SUN Li-ping1, HU Chao-feng2, ZHANG Xin-zhou1

(1DepartmentofNephrology,ShenzhenPeople’sHospital,SecondClinicalMedicalCollege,JinanUniversity,Shenzhen518020,China;2DepartmentofPathophysiology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:xin.zhou@medmail.com.cn)

[KEY WORDS]Tumor necrosis factor receptor associated factor 3; NF-κB; Apoptosis; Cyst formation, kidney

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effects of tumor necrosis factor (TNF) receptor associated factor 3 (TRAF3) on the signaling pathway of NF-κB and the expression of Bax and Bid in renal collecting duct epithelial cells of polycystic kidney disease (PKD), and to observe the tubulogenesis of TRAF3 transgenics for exploring the protective effect of TRAF3 on the cystogenesis and development of PKD. METHODS: The signaling changes of NF-κB and expression of Bax and Bid in PKD renal collecting duct epithelial cells and TRAF3 transgenic PKD renal collecting duct epithelial cells were determined by the Western blot. The percentage of apoptotic cells was measured by flow cytometry with Annexin V staining. The caspase-3 activity was also measured. The 3D Matrigel culture was performed to examine abnormal tubulomorphogenesisinvitro. RESULTS: The over-expression of TRAF3 significantly inhibited the signaling pathway of NF-κB in PKD renal collecting duct epithelial cells and significantly downregulated the expression of Bax and Bid, and also decreased the cell apoptosis. More branch structures were observed in the TRAF3 transgenic PKD renal collecting duct epithelial cells. CONCLUSION: TRAF3 is a negative regulatory inhibitor for Bax and Bid by regulating the NF-κB signaling and may be a new target for inhibiting the cyst formation in PKD．

[文章編號]1000- 4718(2016)06- 1077- 07

[收稿日期]2016- 03- 31[修回日期] 2016- 04- 29

*[基金項目]廣東省科技計劃(No. 2014A020212472)；深圳市科技計劃(No. JCYJ20150403101146288)

通訊作者△Tel: 0755-22943522; E-mail: xin.zhou@medmail.com.cn

[中圖分類號]R681.3; R363.2

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.020