趨化因子CXCL17在胃癌組織中的表達及其臨床相關性研究*

余進龍，　阮靜瑤，　李松翰，　何邦杰，　朱娉逸，　薛向陽，　鄒阮敏，　林刻智

(溫州醫科大學1第一臨床醫學院，2微生物與免疫學教研室，3附屬第一醫院婦產科，4基礎醫學中心，浙江 溫州 325035)

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趨化因子CXCL17在胃癌組織中的表達及其臨床相關性研究*

余進龍1，阮靜瑤1，李松翰1，何邦杰1，朱娉逸1，薛向陽2，鄒阮敏3△，林刻智4△

(溫州醫科大學1第一臨床醫學院，2微生物與免疫學教研室，3附屬第一醫院婦產科，4基礎醫學中心，浙江 溫州 325035)

[摘要]目的： 分析趨化因子CXCL17在胃癌及癌旁正常組織的表達及分布情況，并探討其差異表達的臨床意義。方法: 分別采用實時熒光定量PCR和免疫組化對40例術后切除的胃癌及相應癌旁正常胃組織CXCL17的表達及分布情況進行檢測。通過臨床病理分析及Kaplan-Meier生存曲線的分析，明確CXCL17在胃癌組織中的表達情況及其臨床意義。結果: CXCL17蛋白和mRNA的表達在胃癌組織較癌旁正常組織明顯降低(P<0.05)。臨床病理數據分析顯示，CXCL17表達的下調與胃癌分化程度有關(P<0.01)，與病人性別、年齡、淋巴結轉移、原發部位腫瘤大小、腫瘤分期、癌胚抗原表達水平等未見明顯相關性。Kaplan-Meier生存分析顯示，CXCL17高表達組相對低表達組有明顯的生存延長(P<0.05)。結論: CXCL17可作為胃癌預后的關鍵因素之一參與胃癌的發生發展。

[關鍵詞]胃癌； 趨化因子CXCL17； 生存分析

胃癌是全球最常見的消化道惡性腫瘤之一。尤其在我國胃癌死亡率是歐美發達國家的4～8倍，近30年來胃癌的發病率及死亡率一直位居惡性腫瘤的前三位，是危害我國人民身體健康的重大疾病[1-2]。目前的研究顯示，腫瘤微環境在胃癌形成過程中發揮了重要的作用，特別是局部低氧、酸性微環境和間質高壓等特性均十分有利于腫瘤的增殖、侵襲和惡性轉化[3]。腫瘤微環境主要包括基質細胞、免疫細胞、細胞因子、腫瘤細胞、趨化因子及其受體等，其中趨化因子的表達水平改變，可影響局部的抗腫瘤免疫反應以至于腫瘤治療的轉歸[4]。

CXCL17又名血管內皮生長因子共調節趨化因子1[vascular endothelial growth factor (VEGF) co-regulated chemokine 1，VCC-1]，最初于2006年發現，在正常人體的呼吸、消化以及部分泌尿生殖系統有不同程度的表達[5-6]，具有募集免疫細胞、抗炎、抗菌、促進血管生成等多種生物學功能[6-7]，其中促進血管生成的活性與腫瘤血管生成密切相關，引起了研究人員的關注。目前，CXCL17與肝癌、胰腺癌、乳腺癌和結腸癌等部分腫瘤的關系已經有相關報道，而在胃癌組織中的表達水平及臨床意義未見相關報道。本課題組在研究趨化因子CXCL14與胃癌的關系時[8]，意外地發現趨化因子CXCL17在基因表達譜中呈下調趨勢，這使我們猜測其是否可能與胃癌的發展相關？為探討CXCL17與胃癌的關系，本研究主要通過免疫組化、實時熒光定量PCR等技術并結合臨床病理數據分析以及生存分析，明確CXCL17在胃癌組織中蛋白和mRNA的表達水平及其臨床意義。

材料和方法

1主要試劑

TRIzol試劑購自Invitrogen；ReverTra Ace逆轉錄試劑盒和SYBR Master Mix熒光定量PCR試劑盒購自Toyobo；小鼠抗人CXCL17蛋白Ⅰ抗購自R&D；HRP標記羊抗小鼠Ⅱ抗、羊血清和DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物公司；引物由華大基因科技股份有限公司合成。

2組織標本采集及處理

40例胃癌及相應癌旁正常組織均取自溫州醫科大學附屬第一醫院的胃癌術后標本。胃癌的病理學診斷由醫院病理科術后根據WHO的標準證實。所有患者術前未接受放療或化療，且在術后根據NCCN胃癌指南接受嚴格化療。以上胃癌組織及相應癌旁正常組織(取自距癌灶5 cm處)的配對標本(胃癌及其癌旁正常組織)均被分為2個部分：一部分標本在手術切除后30 min內在液氮中保存，以備RNA提取；另一部分標本經4%甲醛固定，石蠟包埋，用于免疫組化檢測。

3方法

3.1免疫組化實驗5 μm的石蠟切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、3% H2O2阻斷內源性過氧化氫酶。微波修復，冷卻至室溫后，羊血清封閉1 h。甩去血清，滴加CXCL17特異性抗體，4 ℃冰箱孵育過夜。次日，室溫下復溫30 min。參照說明書，滴加羊抗鼠II抗，37 ℃孵育30 min。PBS清洗，甩干。DAB顯色。蘇木素復染、中性樹膠封片。每次實驗均以已知免疫組化染色陽性的切片作陽性對照,以PBS代替I抗作陰性對照以確保實驗結果可靠性。平均吸光度值由Image-Pro Plus 6.0軟件計算所得。

3.2RNA抽提和熒光定量PCR實驗總RNA的抽提參照TRIzol試劑說明書，提自液氮保存的胃癌及其相應癌旁正常組織；經異丙醇離心沉淀后置于-20 ℃過夜；次日，去上清，75%乙醇再次離心沉淀并棄上清。將RNA沉淀溶于DEPC水，經紫外分光光度計檢測RNA的純度及濃度，并于-80 ℃儲存，用于定量PCR實驗。

cDNA第一鏈由提取自組織的RNA參照ReverTra Ace逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄而來。反應結束后置于-20 ℃保存。以20 μL反應體系進行real-time PCR。相關引物序列信息見表1。反應體系包括 1 μL逆轉錄產物、2×SYBR Green I Master Mix、0.5 μmol/L上游引物和0.5 μmol/L下游引物。程序設定為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環40次(StepOnePlusTMReal-Time PCR system)。所有樣品均嚴格按照3個復孔進行實驗。根據待測標本的Ct值，以GAPDH為內參照，采用相對定量法，以2-ΔΔCt表示標本中CXCL17相對表達量，其中ΔΔCt=(CtCXCL17-CtGAPDH)腫瘤-(CtCXCL17-CtGAPDH)癌旁。

4統計學處理

應用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析。對免疫組化結果與各臨床病理因素的相關性進行獨立樣本t檢驗和卡方檢驗。用Kaplan-Meier法對CXCL17高表達組與低表達組生存分析進行5年生存率分析，組間差異比較用log-rank檢驗。所涉及的數據均以均數±標準差(mean±SD)表示，P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1胃癌組織中CXCL17 mRNA的表達下調

RT-PCR電泳結果顯示在255 bp左右的癌旁正常組織電泳結果可見明亮的單一條帶，而癌組織在相應位置處的條帶微弱或無條帶。為了檢測CXCL17在胃癌組織中的表達量，我們建立了特異且敏感的實時熒光定量PCR體系，CXCL17與GAPDH的熔解曲線均為單一尖峰，證明我們所建立的體系能夠特異地擴增目的基因,用以分析mRNA的相對表達量。2-ΔΔCt法分析顯示，腫瘤組織中CXCL17的mRNA表達量相對于癌旁正常組織而言明顯降低，僅為癌旁正常組織的0.68,見圖1。

Figure 1.The mRNA expression of CXCL17 in human gastric cancer and gastric tissues. N: normal; T: tumor; blank: blank control. Mean±SD.n=40.*P<0.05vsnormal.

圖1胃癌及癌旁組織CXCL17的mRNA表達水平

2免疫組化結果表明CXCL17蛋白在胃癌組織中表達下降

免疫組化結果顯示在癌旁正常胃組織中，CXCL17主要表達在胃壁組織黏膜部位細胞胞漿中，染色顆粒呈棕褐色強陽性顯色。然而，在腫瘤組織中，CXCL17的表達顯著降低甚至不表達，免疫組化染色呈淡黃色或不著色。用Image-Pro Plus 6.0半定量分析免疫組化結果，發現CXCL17蛋白在胃癌組織中的表達水平(0.20±0.08)顯著低于癌旁正常組織(0.38±0.06)，且兩者差異具有統計學顯著性(P<0.01),見圖2。

Figure 2.The protein expression of CXCL17 in the gastric cancer and normal tissues (immunohistochemical staining, ×400). A: normal (n=40); B: well-differentiated (n=7); C: moderately-differentiated (n=12); D: poorly-differentiated (n=11); E: undifferentiated (n=10). Mean±SD.**P<0.01vsB;##P<0.01vsC.

圖2胃癌和癌旁正常組織CXCL17表達水平

3CXCL17蛋白表達水平與胃癌臨床病理特征分析

通過對40例腫瘤組織中CXCL17蛋白表達水平與其臨床病理特征的相關性分析，結果顯示CXCL17與胃癌腫瘤的病理分化類型密切相關，主要表現為腫瘤分化程度越高，CXCL17蛋白表達越高。并且低分化或不分化的腫瘤組織蛋白表達明顯低于高分化或中分化組織，高分化胃癌組織染色為深黃色，中分化、低分化組織為淡黃色，低分化組織幾乎不表達CXCL17蛋白，表達水平差異顯著(P<0.01)。對CXCL17蛋白表達與年齡、性別、淋巴結轉移、腫瘤大小和腫瘤分期等的相關性進行分析未見統計學顯著性，見表2。

4腫瘤組織中CXCL17表達水平與胃癌預后相關性

根據40例腫瘤組織中CXCL17表達的平均吸光度值數據分布情況，以平均值A=0.251為界限，A低于0.251為CXCL17低表達組(20例)，其余為高表達組(20例)。以Kaplan-Meier法對2組生存情況進行5年生存率分析，并使用log-rank檢驗對生存曲線的差異進行顯著性檢驗，結果顯示不同CXCL17蛋白表達水平的胃癌患者術后總生存之間的差異有統計學顯著性 (P<0.05)，高表達組相對低表達組而言有明顯的生存延長，表明CXCL17高表達的胃癌患者手術預后情況更優。高、低表達組生存期分別為(26.2±3.8)月和(10.4±3.1)月,見圖3。

討論

CXCL17是趨化因子CXC家族最新發現的一員，是由多種細胞分泌的，能夠使不同細胞發生趨化運動的細胞因子，其在腫瘤中的分泌能夠影響腫瘤細胞的免疫反應，調節腫瘤細胞的增殖及轉移，且與腫瘤血管生成密切相關[4-5]。相關報道指出，在胰腺癌中，隨著腫瘤惡性程度的提升，CXCL17的表達反而降低[9],而在肝癌、乳腺癌、結腸癌中，CXCL17表達卻上升[10-11]。CXCL17在不同腫瘤組織中呈現的不同表達情況，Weinstein等[5]認為CXCL17能夠誘導VEGF等因子表達從而間接促進腫瘤血管生成，加速腫瘤瘤體生長；而Hiraoka等[9]則認為，CXCL17可募集樹突狀細胞浸潤腫瘤組織，介導T細胞的免疫應答，產生抗腫瘤免疫作用。

Figure 3.Survival curves of the gastric cancer patients with different expression levels of CXCL17.

圖3胃癌患者CXCL17不同表達水平的生存曲線比較

為研究CXCL17在胃癌中的表達情況，本課題組通過real-time PCR和免疫組化等技術檢測胃癌組織及相應的癌旁正常組織中CXCL17的表達水平。免疫組化結果顯示，在癌旁正常胃組織中CXCL17蛋白呈棕黃色，且主要表達在黏膜部，這與Burkhardt等[6]的研究結果相符；在胃癌組織中CXCL17的表達較癌旁正常組織有明顯下降，并且隨著腫瘤惡性度的增高，CXCL17的表達也相應下降，這種表達下調的情況與Hiraoka等[9]在胰腺癌的研究類似。RT-PCR電泳，胃癌癌旁正常組織在255 bp處可見一清晰條帶，而胃癌組織中僅隱約可見或無；且實時熒光定量PCR結果顯示，在胃癌組織中CXCL17的表達較癌旁正常組織有明顯下降。可見，CXCL17在胃癌及癌旁正常胃組織中蛋白與基因表達結果一致。基于Hiraoka等[9]在胰腺癌中的研究，我們推測CXCL17在胃癌中的表達下調，極有可能與腫瘤逃避機體免疫監視并形成腫瘤免疫耐受有關。

通過近5年臨床隨訪資料，進一步進行臨床數據統計，結果發現CXCL17在胃癌組織蛋白的表達與腫瘤分化程度具有顯著相關性，而與與年齡、性別、淋巴結轉移、腫瘤大小和腫瘤分期等無關。生存分析顯示腫瘤組織CXCL17蛋白高表達水平患者生存期相對較長，這提示CXCL17可能參與了胃癌發展的過程，且發揮一定的抗腫瘤作用。

綜上所述，CXCL17在胃癌中可能扮演了一個抑癌角色，參與胃癌的發生發展。在今后的研究中，我們將進一步探索腫瘤組織中免疫細胞與CXCL17的關系，并深入從基因水平探討CXCL17在胃癌中下調的具體機制，為胃癌臨床治療及預后提供新靶點，為胃癌的臨床藥物研發提供新思路。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Expression of chemokine CXCL17 and its clinical relevance in gastric carcinoma

YU Jin-long1, RUAN Jing-yao1, LI Song-han1, HE Bang-jie1, ZHU Ping-yi1, XUE Xiang-yang2, ZOU Ruan-min3, LIN Ke-zhi4

(1TheFirstClinicalMedicalAcademy,2DepartmentofMicrobiologyandImmunology,3DepartmentofObstetricsandGynecology,TheFirstAffiliatedHospital,4MedicalExperimentalTeachingCenter,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China.E-mail:lkz_2013@163.com; 60447697@qq.com)

[KEY WORDS]Gastric cancer; Chemokine CXCL17; Survival analysis

[ABSTRACT]AIM: To investigate the expression and distribution of chemokine CXCL17 in gastric cancer and its clinical significance.METHODS: The CXCL17 expression was detected by real-time PCR and immunohistochemistry. The correlation between the CXCL17 expression and clinicopathological features was statistically analyzed and Kaplan-Meier survival analysis was used to evaluate the prognosis.RESULTS: A lower expression levels of CXCL17 were observed in the tumor tissues compared with the paired normal tissues (P<0.05). Down-regulation of CXCL17 was associated with the degree of tumor differentiation and the size of tumor at primary site (P<0.05). Kaplan-Meier survival analysis showed that increased CXCL17 in the tumor tissues was associated with longer survival time.CONCLUSION: The result might illustrate that CXCL17 acts as a key factor in the prognosis of gastric cancer and is closely associated with the progression of gastric cancer.

[文章編號]1000- 4718(2016)06- 1022- 05

[收稿日期]2015- 12- 18[修回日期] 2016- 03- 23

*[基金項目]浙江省自然科學基金青年項目(No. LQ16H190003)；溫州市科技計劃項目(No. Y20140216；No. Y20140308)；浙江省大學生科技創新活動計劃(新苗人才計劃)資助項目(No. 2015R413004)

通訊作者△鄒阮敏 Tel: 0577-88069240; E-mail: 60447697@qq.com； 林刻智 Tel: 0577-86689816; E-mail: lkz_2013@163.com

[中圖分類號]R730.23

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.010