中胚層分化蛋白2對視網膜色素上皮細胞吞噬功能的影響*

陳秀萍，　袁源智，　王歷陽，　袁　非

(復旦大學附屬中山醫院眼科，上海 200032)

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中胚層分化蛋白2對視網膜色素上皮細胞吞噬功能的影響*

陳秀萍，袁源智，王歷陽，袁非△

(復旦大學附屬中山醫院眼科，上海 200032)

[摘要]目的： 觀察中胚層分化蛋白2對視網膜色素上皮細胞吞噬功能的影響。方法: 采用人D407細胞和體外培養新生小鼠視網膜色素上皮細胞，加入不同劑量的純化中胚層分化蛋白2，通過共聚焦顯微鏡及流式細胞術觀察視網膜色素上皮細胞結合和內吞視桿細胞外節盤膜的情況。結果: 中胚層分化蛋白2主要表達在視桿細胞外節盤膜層，與視桿細胞外節盤膜生物標志物視紫紅質完全共定位，純化的中胚層分化蛋白2可刺激人D407細胞及小鼠原代視網膜色素上皮細胞吞噬視桿細胞外節盤膜，吞噬體生物標志物Rab7與攝入的視桿細胞外節盤膜共定位，D407細胞吞噬視桿細胞外節盤膜與中胚層分化蛋白2的濃度呈劑量依賴性，但在達到飽和濃度后其吞噬能力下降，中胚層分化蛋白2可結合至視桿細胞外節盤膜及D407細胞表面。結論: 中胚層分化蛋白2對視網膜色素上皮細胞吞噬功能有促進作用。

[關鍵詞]中胚層分化蛋白2； 吞噬； 視網膜色素上皮細胞

吞噬(phagocytosis)是一個重要的生物學過程，可以清除凋亡細胞、細胞碎片和有害代謝產物，維持組織的平衡，損傷的修復和先天免疫平衡[1-2]。吞噬功能障礙可能導致代謝廢物堆積，自身免疫性疾病及組織變性。視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞的吞噬作用對維持視網膜穩態和感光體活力是必需的[3]。RPE功能受損，消化后的代謝物不能及時清除，形成脂褐質和玻璃膜疣，繼而Bruch膜與色素上皮細胞變性, 是發生年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)的重要因素。

低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)受體家族的所有成員都被視為細胞表面胞吞受體，其在細胞吞噬中起到重要作用，例如最早發現的人LDL受體，其介導含膽固醇的脂蛋白顆粒的內吞作用；中胚層分化蛋白2(mesoderm development candidate 2，Mesdc2)是LDL受體家族低密度脂蛋白受體相關蛋白(LDL receptor-related protein, LRP)的內質網(endoplasmic reticulum，ER)分子伴侶[4]，已被報道與LRP5、LRP6[5]及LRP4[6]結合。

本研究使用人D407細胞及原代小鼠RPE細胞，證實了Mesdc2可促進RPE細胞吞噬，Mesdc2主要表達在感光細胞外節段(photoreceptor outer segment，POS)的細胞質，可促進D407 RPE細胞和原代RPE細胞吞噬POS盤膜，其減少極有可能是RPE細胞吞噬功能下降的一個重要原因。

材料和方法

1材料

C57BL/6小鼠(上海斯萊克實驗動物有限公司提供)，6～8周齡及7～10日齡。 人D407細胞、HEK293細胞和新鮮牛眼(上海富衡生物科技有限公司提供)。

2主要試劑與儀器

DMEM培養液(Gibco)；MEM培養液、聚L-賴氨酸和蛋白酶抑制劑(Sigma)，胎牛血清(天津TBD公司)；異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)和pHrodo標記盒(Thermo Fisher)；RIPA緩沖液裂解液(Pierce)；TCS SP5共聚焦顯微鏡及其軟件分析系統 LAS AF (Leica)。

3方法

3.1Mesdc2質粒制備及蛋白提純用RT-PCR產生的小鼠Mesdc2 cDNA通過PCR擴增與C末端FLAG標簽相連，并用BglⅡ和NotⅠ位點克隆到pEGFP-N1質粒(Clontech)，以取代GFP，生成Mesdc2-FLAG質粒。另外，編碼序列通過PCR擴增，用BglⅡ和XhoⅠ消化，克隆至pMAL-C4E質粒(New England Biolab)的BamH Ⅰ、SalⅠ和XbaⅠ位點，組成麥芽糖結合蛋白(maltose-binding protein, MBP) -Mesdc2質粒。所有的質粒通過DNA測序驗證。將MBP-Mesdc2和pMAL-C4E質粒轉化到BL21(DE3)細菌，之后用IPTG誘導，使用直鏈淀粉柱純化MBP-Mesdc2和MBP蛋白，用PBS透析，并用SDS-PAGE進行分析。

3.2原代小鼠RPE細胞培養用CO2處死10日齡C57BL/6小鼠，立即取出眼球，在無菌狀態下沿鋸齒緣將眼球剪開，棄去角膜，晶狀體和視網膜后，將胰蛋白酶加入RPE眼杯37 ℃消化3 min，10%胎牛血清終止消化，用吸管輕輕吹打，使RPE細胞脫落分離成單個細胞，離心后收集細胞，加入MEM(含10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、1×非必需氨基酸、青霉素/鏈霉素、重組人堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)10 μg/L、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)1 μg/L、1×N1 Supplement、牛磺酸210 μg/L、氫化可的松1.2 mg/L和三碘甲狀腺氨酸60 μg/L)，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。將培養基每2～3 d更換1次，直到RPE細胞長出。用胰蛋白酶解離細胞，在吞噬實驗前3 d更換無bFGF和EGF的培養基。

3.3POS盤膜提取取死亡24 h內新鮮牛眼，4 ℃下，將分離的視網膜輕輕地在含有2.5%蔗糖的PBS中振蕩15 min，移去視網膜之后，分離的POS盤膜經過2次38 700×g離心30 min收集并洗滌。純化的POS盤膜用pHrodo標記盒標記[7]。POS盤膜與pHrodo(500 μg)孵育30 min后，于室溫下在含1% BSA的PBS中孵育15 min。在吞噬實驗前30 min該標記的盤膜用PBS 16 000×g離心5 min洗滌2次。

3.4RPE細胞吞噬POS盤膜實驗采用雙重熒光標記法。分別用pHrodo和DAPI標記POS盤膜及RPE細胞。將D407細胞或原代RPE細胞接種在預先涂有聚L-賴氨酸玻璃片的12孔板，培養過夜，待細胞生長孵育至80%融合時，將MBP-Mesdc2及MBP按所示濃度分別與pHrodo標記POS盤膜(50 mg/L)加入到RPE細胞37 ℃、5% CO2培養箱中孵育3 h，4 h時用PBS充分沖洗，將游離的POS盤膜去除，將細胞用4%多聚甲醛固定10 min，PBS沖洗干凈，細胞核用DAPI染色，通過共聚焦顯微鏡及流式細胞術分析。胞內pHrodo信號通過ImageJ軟件分析。

吞噬功能分析按參考文獻的方法[8]，采用Leica TCS SP5 共聚焦顯微鏡及 LAS AF軟件系統進行拍攝，每組隨機拍攝5個視野，并選取中間的一組進行統計。采用ImageJ軟件定量分析每幅圖像中的熒光量。每幅圖像中的吞噬熒光量/每幅圖像中DAPI熒光量即為熒光密度。

3.5免疫組化熒光標記和免疫共定位實驗取6～8周齡C57BL/6小鼠于麻醉下用10%福爾馬林灌注心臟。眼球在相同固定液中4 ℃過夜，去除角膜和晶狀體后，將眼杯孵育蔗糖梯度溶液10%和20%各3 h；30% 4 ℃過夜，然后進行3輪凍融和OCT包埋，制成7 μm厚的冰凍組織切片。分別用兔抗Mesdc2和小鼠抗視紫紅質的抗體孵育，再用Alexa594標記的山羊抗兔IgG抗體和Alexa488標記的山羊抗小鼠IgG抗體，細胞核用DAPI標記，通過共聚焦顯微鏡分析熒光信號。

采用3種熒光標記，分別用pHrodo標記POS盤膜，DAPI標記RPE細胞，D407細胞與pHrodo標記POS盤膜共同孵育3 h，4%多聚甲醛固定10 min，用含有1%Triton X-100的PBS透化，再加入抗Rab7抗體，然后通過FITC標記的 II 抗定位Rab7。通過共聚焦顯微鏡分析細胞內的熒光信號。

3.6檢測人D407細胞表達Mesdc2的mRNA水平(1) RNA提取：取10 cm2D407細胞加入1 mL TRIzol，倒入1.5 mL的Eppendorff管中，先后以氯仿、異丙醇、75%乙醇處理RNA樣品后，加入20 μL的DEPC溶解，測定吸光度(A)值后，計算樣品RNA濃度。 (2) 逆轉錄PCR：逆轉錄合成cDNA第1鏈，逆轉錄反應體系(12 μL)：1 μL引物，10 μL模板RNA，1 μL dNTP，2 μL DEPC，65 ℃ 5 min;再加入4 μL 5×first-strand buffer，2 μL 0.1 mol/L DTT，1 μL RNase inhibitor，42 ℃ 2 min;再加入1 μL SSIII逆轉錄酶，42 ℃ 50 min，70 ℃ 15 min。(3) PCR反應體系(20 μL)：GAPDH上游引物和下游引物各1 μL，人Mesdc2上游引物和下游引物各1 μL，5倍PCR緩沖液4 μL，TaKaRa EX TaqTMHS 0.4 μL，滅菌ddH2O 12.6 μL，逆轉錄產物 1 μL。PCR反應條件為:94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個循環;4 ℃終止反應。人Mesdc2的上游引物序列為5’-ATGGCGGCTTCCAGGTGGGC-3’，下游引物序列為5’-ACTGCTGCCCCATCACAGGT-3’，擴增片段長度為716 bp；GAPDH作為內參照， 上游引物序列為5’- CTTCACCACCATGGAGAAGGC-3’，下游引物序列為5’-ATGAGGTCCACCACCCTGTTG-3’，擴增片段長度為681 bp。

3.7檢測小鼠視網膜表達Mesdc2的mRNA水平(1) RNA提取：取2個小鼠視網膜加入1 mL TRIzol，研磨組織后倒入1.5 mL的Eppendorff管中，先后以氯仿、異丙醇、75%乙醇處理RNA樣品后，加入20 μL的DEPC溶解。測定吸光度(A)值后，計算樣品RNA濃度。 (2) 逆轉錄PCR:采用兩步法進行逆轉錄PCR檢測。逆轉錄合成cDNA第1鏈。逆轉錄反應體系：1 μL引物，8 μL模板RNA，1 μL dNTP，2 μL DEPC，65 ℃ 5 min；再加入4 μL 5× first-strand buffer, 2 μL 0.1 mol/L DTT，1 μL RNase inhibitor，1 μL SSIII逆轉錄酶，50 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min。 (3) PCR反應體系(20 μL)：GAPDH上游引物和下游引物各1 μL，小鼠Mesdc2上游引物和下游引物各1 μL，5倍PCR緩沖液4 μL，TaKaRa EX TaqTMHS 0.4 μL，滅菌ddH2O 12.6 μL，逆轉錄產物1 μL。PCR反應條件為:94 ℃ 2 min; 94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個循環; 4 ℃終止反應。小鼠Mesdc2上游引物序列為5’-TCAGATCTATGGCGGACACTCCGGGCGAGG-3’，下游引物序列為5’-TTCTCGAGCTAAAGGTCTTCTCTTCTGCTCCC-3’，擴增片段長度為587 bp；GAPDH作為內參照， 上游引物序列為5’-GTGCAGCGAACTTTATTGATGG-3’，下游引物序列為5’-TGGTGAAGCAGGCATCTGAG-3’，擴增片段長度為403 bp。取5 μL擴增產物與1 μL 6倍的loading緩沖液混合后，加入1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳緩沖液為1倍Tris-硼酸-EDTA緩沖液，室溫下恒定電壓170 V，電泳30 min。使用BLS303PC凝膠自動成像系統記錄。

3.8免疫印跡法檢測Mesdc2的表達取牛POS及視網膜組織用RIPA裂解液裂解提取組織蛋白，并通過使用抗Mesdc2抗體和HRP標記的II抗進行Western blot分析。

3.9POS盤膜與Mesdc2的結合實驗將HEK293細胞用Mesdc2-FLAG或GFP-FLAG質粒轉染48 h。用蛋白酶抑制劑通過3次冷凍-解凍得到細胞裂解物，隨后在4 ℃下16 000×g離心30 min，將裂解液通過0.2微米的過濾器過濾。 4 ℃下POS盤膜(500 μg)與細胞裂解物共同孵育1 h，用PBS洗滌并離心5次。POS結合Mesdc2-FLAG或GFP-FLAG用鼠抗FLAG單克隆抗體，然后Alex594羊抗鼠II抗，使用流式細胞術檢測。

3.10D407細胞與Mesdc2結合實驗4 ℃下D407與細胞裂解物共同孵育1 h，用PBS洗滌并離心5次。 D407細胞結合Mesdc2-FLAG或GFP-FLAG用鼠抗FLAG單克隆抗體，然后Alex594羊抗鼠II抗，使用流式細胞術檢測。

4統計學分析

使用統計軟件SPSS 16.0行統計學分析。所有實驗至少獨立重復3次，數據按均數±標準誤(mean±SEM)表示，組間兩兩比較使用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1Mesdc2在小鼠視網膜的表達

與巨噬細胞和小膠質細胞不同，RPE細胞是固定的吞噬細胞，因此Mesdc2在視網膜表達的位置非常重要，與其作為RPE細胞吞噬配體高度相關。我們首先通過RT-PCR驗證其在視網膜中的表達。其次我們通過免疫印跡檢測Mesdc2在視網膜和POS表達的量，我們在POS中沒有檢測到β-肌動蛋白，這可能與POS的特殊結構有關。我們進一步通過免疫組化檢測Mesdc2在視網膜中的表達，抗Mesdc2和抗視紫紅質抗體可以驗證其在視網膜的表達，結果表明Mesdc2主要表達在POS層，與POS生物標志物視紫紅質完全共定位，雖然視網膜各層均有表達，但表達量遠少于POS層，表明Mesdc2集中表達在具有促進RPE細胞吞噬作用的有利表達部位，見圖1。

Figure 1.The expression of Mesdc2 in mouse retina. A: Mesdc2 expression in mouse retina detected by RT-PCR; B: Mesdc2 expression in the bovine retina and POSs detected by Western blot; C: Mesdc2 and rhodopsin expression and co-localization in mouse retina detected by immunohistochemistry.

圖1Mesdc2在小鼠視網膜中的表達分析

2Mesdc2促進D407細胞吞噬POS盤膜

pHrodo是pH敏感的熒光染料，從新鮮牛眼制備的POS用pHrodo標記后，在被吞噬成為酸性吞噬體后，其熒光強度明顯增強[8]，結合共聚焦顯微鏡可明確區分攝入和未攝入的POS。同時使用流式細胞儀檢測被吞噬的POS熒光信號。共聚焦顯微鏡結果表明，純化的Mesdc2可刺激人D407 RPE細胞吞噬POS，pHrodo信號與亮視野顯微鏡圖疊加圖像清楚地顯示，標記的POS被吞噬進D407細胞。加入Mesdc2的D407細胞吞噬POS明顯多于MBP，差異具有統計學顯著性(P<0.01)。同時我們做了濃度梯度的實驗，發現D407細胞吞噬POS與Mesdc2的濃度呈現劑量依賴性，但在達到飽和濃度后其吞噬能力下降，而MBP不具有此特征，兩者在50 nmol/L、100 nmol/L和200 nmol/L比較差異有統計學顯著性，其中100 nmol/L 達到吞噬的峰值(P<0.01), 見圖2。

3Mesdc2促進原代小鼠視網膜色素上皮細胞吞噬POS

我們使用新生小鼠眼球制備原代RPE細胞與Mesdc2蛋白及POS共同孵育，分析其促吞噬作用，MBP蛋白作為陰性對照。結果表明Mesdc2可誘導原代RPE細胞吞噬POS，而MBP沒有誘導RPE細胞吞噬，兩者比較差異有統計學顯著性(P<0.01)。這些結果表明，人D407和原代小鼠RPE細胞具有相似的吞噬機制,見圖3。

4Mesdc2能與POS和D407細胞結合

本實驗將Mesdc2-FLAG或GFP-FLAG細胞裂解物分別與脫落的POS盤膜及D407細胞一起孵育，通過流式細胞術證實Mesdc2-FLAG可結合至POS盤膜及D407細胞表面, GFP-FLAG作為陰性對照。在與POS盤膜的結合實驗中，GFP為5.5%，Mesdc2為42.8%。在D407細胞的結合實驗中，GFP為0.3%，Mesdc2為64.2%，差異均有統計學顯著性,見圖4。

5Mesdc2通過吞噬體介導內吞

我們使用吞噬體生物標志物Rab7來驗證Mesdc2介導POS攝入是通過吞噬途徑，在Mesdc2組，Rab7與攝入的POS共定位，MBP是陰性對照，因此Mesdc2介導的內化是通過靶向攝取POS到吞噬體的一個吞噬過程,見圖5。

Figure 2.Mesdc2 stimulated the phagocytosis of D407 cells. A: the phagocytosis of pHrodo by D407 cells stimulated by Mesdc2, MBP was negative control; B: quantification of relative fluorescence intensity in D407 cell phagocytosis stimulated by Mesdc2 and MBP; C: quantification of relative fluorescence intensity in D407 cell dose-dependent phagocytosis stimulated by Mesdc2 and MBP. Mean±SEM.n=5.*P<0.05,**P<0.01vsMBP.

圖2Mesdc2促進D407細胞吞噬

Figure 3.Mesdc2 stimulated phagocytosis of mouse primary RPE cells. A: the phagocytosis of pHrodo by mouse primary RPE cells stimulated by Mesdc2, MBP was negative control; B: quantification of relative fluorescence intensity in mouse primary RPE cell phagocytosis stimulated by Mesdc2 and MBP. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vsMBP.

圖3Mesdc2促進小鼠原代視網膜色素上皮細胞吞噬

Figure 4. The binding of Mesdc2 with POS (A) and D407 cells (B) analyzed by flow cytometry. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vsGFP-FLAG.

圖4流式細胞術分析Mesdc2-FLAG與POS和D407細胞的結合情況

Figure 5. The co-localization of pHrodo and Rab7 in D407 cells observed by confocal microscopy. The pHrodo signal (red) co-loca-lized with Rab7 signal (green).

圖5共聚焦顯微鏡下檢測D407細胞攝入的POS與Rab7共定位

討論

年齡相關性黃斑變性的一個顯著特征是細胞內脂褐素和細胞外玻璃膜疣的沉積，隨后出現RPE細胞的缺失、感光細胞的損傷及Bruch膜的改變、新生血管長入等病理改變。隨著研究的深入, 人們逐漸認識到RPE細胞吞噬及降解POS功能的異常在AMD的發病中起著重要的作用[9]。在老年小鼠RPE中脂褐素的含量約為剛出生時的20倍，并且脂褐素的蓄積阻礙RPE吞噬POS盤膜[10]。還有研究發現, 未吞噬的POS碎片由RPE細胞頂端轉移到RPE下，參與形成玻璃膜疣[11]。

Mesdc2是LRP家族的分子伴侶，可促進細胞表面LRP分子的折疊和表達。例如促進LRP1，2，4，5，6的表達[6]。敲除Mesdc2可導致LRP5/6的異常表達和胚胎極性的破壞[12-13]。LRP家族的內吞活性和信號轉導是眾所周知的。LRP1是一種多功能的清道夫受體[14]。LRP1有至少30個不同的配體，參與脂蛋白代謝和病毒及細菌毒素進入細胞。LRP5/6是Wnt信號通路的共同受體，參與內吞作用。

本實驗證實了Mesdc2是一個新的RPE細胞的吞噬配體，它可能從脫落的POS盤膜中被釋放，并與RPE細胞和POS盤膜表面受體結合，并將其連接后進行吞噬清除。Mesdc2在視網膜表達的位置非常重要，與其作為RPE細胞吞噬配體高度相關。本研究發現Mesdc2主要表達在POS層，其它視網膜層也存在低水平表達，雖然視網膜各層均有表達，但表達量遠少于POS，表明Mesdc2集中表達在具有促進RPE細胞吞噬作用的有利表達部位。在感光細胞中，蛋白質主要在光感受器內節層合成，此處即是內質網[15]。成熟的蛋白質通過連接纖毛從內節層轉運到POS層。雖然Mesdc2作為ER伴侶在無內質網的POS層高表達的分子機制還不清楚，但Mesdc2在POS的高表達提示了其可作為配體調節RPE細胞吞噬作用。

本實驗通過人D407細胞和鼠原代RPE細胞驗證了純化的Mesdc2可刺激RPE細胞吞噬POS盤膜，pHrodo信號與亮視野顯微鏡圖疊加圖像清楚地顯示，標記的POS被吞噬進D407細胞。加入Mesdc2的D407細胞吞噬POS盤膜明顯多于MBP，差異具有統計學顯著性，在濃度梯度的實驗，Mesdc2在高濃度(200 nmol/L)刺激的RPE細胞吞噬作用的活性降低，可能在濃度過高時橋接分子效率降低。因此，這些結果支持Mesdc2是一個RPE細胞吞噬橋接分子。

一個蛋白質作為吞噬配體的標準是其可在胞外結合被吞噬體和受體。本實驗通過流式細胞術證實Mesdc2-FLAG可結合至POS盤膜及D407細胞表面，與陰性對照組GFP-FLAG比較，差異明顯，可見Mesdc2可在胞外結合至RPE細胞及POS表面，并促進吞噬，但在RPE細胞和POS的結合受體目前還有待鑒定。

雖然RPE細胞吞噬的分子機制并不明確，但本研究通過多方面的證據獨立驗證Mesdc2是RPE細胞的一個吞噬配體，其中包括其在POS的高表達，刺激誘導RPE細胞吞噬。Mesdc2作為一種新的RPE細胞吞噬配體將有助于深入了解RPE細胞吞噬的分子生物學機制。

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(責任編輯： 林白霜， 羅森)

Effect of Mesdc2 on phagocytosis of retinal pigment epithelial cells

CHEN Xiu-ping, YUAN Yuan-zhi, WANG Li-yang, YUAN Fei

(DepartmentofOphthalmology,ZhongshanHospitalofFudanUniversity,Shanghai200032,China.E-mail:yuan.fei@zs-hospital.sh.cn)

[KEY WORDS]Mesoderm development candidate 2; Phagocytosis; Retinal pigment epithelial cells

[ABSTRACT]AIM: To observe the effect of mesoderm development candidate 2 (Mesdc2) on phagocytosis of retinal pigment epithelial (RPE) cells. METHODS: The purified Mesdc2 protein was used to incubate with mouse primary RPE cells or D407 cells. The bound and ingested photoreceptor outer segments (POSs) by RPE cells were observed by confocal microscopy and flow cytometry. RESULTS: The Mesdc2 protein was expressed throughout the retina, and predominantly in POSs. Internalized POSs were co-localized with phagosome biomarker Rab7, suggesting that Mesdc2-mediated engulfment was involved in a phagocytosis pathway. Mesdc2 stimulated phagocytosis of POS vesicles by D407 RPE cells in a dose-dependent manner. The effect of Mesdc2 on phagocytosis decreased after the saturation concentration. Mesdc2 bound to both D407 RPE cells and shed POS vesicles. CONCLUSION: Mesdc2 stimulates the phagocytosis of retinal pigment epithelial cells.

[文章編號]1000- 4718(2016)06- 1084- 07

[收稿日期]2015- 08- 03[修回日期] 2016- 03- 09

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No. 81470637); 上海市科學技術委員會基金資助項目 (No. 13411950405)

通訊作者△Tel: 021-64041990-2671； E-mail: yuan.fei@zs-hospital.sh.cn

[中圖分類號]R774; R363.2

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.021