納米顆粒技術及其在豬病防治中的應用進展

莊金秋，梅建國，張 倩，姚春陽，李 峰(.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 56600；.黃島出入境檢驗檢疫局，山東 青島 66555)

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納米顆粒技術及其在豬病防治中的應用進展

莊金秋1，梅建國1，張 倩2，姚春陽1，李 峰1
(1.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256600；2.黃島出入境檢驗檢疫局，山東 青島 266555)

摘 要：納米顆粒技術在醫學領域已被廣泛應用于運載多肽蛋白類藥物、輸送免疫調節劑、輸送疫苗等，具有良好的應用前景。該技術在豬病防治中也已被廣泛用于疾病診斷、預防、監測以及治療等方面。通過綜述近年來納米顆粒技術的最新研究進展，以期為臨床更好的防治豬病提供參考。

關鍵詞：納米顆粒；豬病；防治；進展

納米顆粒是用納米級粒子制成的、粒徑在10～100 nm范圍內的超微粒子。納米顆粒具有比表面積大、表面活性中心多、反應活性高、吸附和催化能力強的特點，可作為活性組分（藥物、活性分子、基因、疫苗等）的載體，通過緩釋、靶向輸送、提高組分穩定性等方式，延長活性組分在體內的半衰期，并增強其活性。納米顆粒技術自誕生以來，就因其特殊功效而備受矚目，成為當前研究的熱點，具有良好的應用前景。

1 納米顆粒技術

醫學中的納米顆粒是一種人工制造的、大小不超過100 nm的微型顆粒。它的形態可能是乳膠體、聚合物、陶瓷顆粒、金屬顆粒和碳顆粒等。非生物原的納米顆粒一般包括共聚物水凝膠、納米凝膠、樹狀分子、碳富勒烯、固體脂質納米顆粒、納米乳劑、可生物降解的聚丙交酯－乙交酯（PLGA）等；生物原的納米顆粒包括寡核苷酸、多糖以及可作為抗原、變應原、病原體的相關分子模式等[1]。納米顆粒大小與細胞組分相近，能夠利用細胞內吞作用進入細胞。其不僅具有免疫佐劑活性，有助于抗原在細胞內加工，與主要組織相容性復合體（MHC）分子特異性結合、運輸并遞呈給效應細胞，增強機體產生天然免疫應答，而且還能夠通過多種途徑到達抗原提呈細胞（APCs），調節免疫應答。在預防性和治療性疫苗中，納米顆粒被用作運輸系統增加抗原提呈或作為免疫佐劑激活和增強機體產生免疫應答。近年來，隨著病毒樣顆粒（VLPs）的出現，納米顆粒技術再次興起[2]。

2 納米顆粒技術在豬病防治中的應用

2.1 納米PCR技術

納米PCR技術是一種新型的PCR技術，其原理為把粒徑為1～100 nm的固體納米金屬顆粒懸浮在液體里形成納米流體。由于納米流體相對于普通流體具有更強的熱導性，所以在添加了納米金屬顆粒的PCR熱循環體系中，PCR反應會更快地達到目標溫度，減少在非目標溫度的停留時間，進而縮短整個體系達到溫度平衡所用的時間，最終達到消除非特異性擴增，提高特異性擴增產量的目的。納米PCR檢測方法比常規PCR具有較高的靈敏性、特異性及可重復性，檢測結果可靠。

偽狂犬病病毒（PRV）可引起母豬繁殖障礙及初生仔豬大批死亡；成年豬則出現隱性感染，長期帶毒排毒，嚴重影響種豬場生產及優良品種的推廣，給養豬業造成極大的損失。控制和消滅豬偽狂犬病所面臨的主要困難是確定偽狂犬病病毒的潛伏感染、野毒感染或疫苗感染。馬興杰等（2014）建立了鑒別PRV強弱毒高效納米PCR檢測方法，并對相關條件進行優化，組裝了試劑盒。對我國黑龍江、吉林等7個省市的117份樣品的檢測結果顯示，PRV強毒陽性率為51%，陰性率為49%，未發現有弱毒感染。鑒別PRV強弱毒納米PCR試劑盒的研制，對PRV感染的早期檢測、野毒株和疫苗株的鑒別、疾病控制等都有重要意義。

豬細小病毒（PPV）是引起母豬繁殖障礙的主要病原之一，衣殼蛋白VP2 是PPV的主要結構蛋白，決定著PPV的組織嗜性、毒力和血凝活性，并且能夠誘導機體產生中和抗體。VP2在桿狀病毒表達載體系統（BEVS）中能夠自我組裝成VLPs，是亞單位疫苗研究的首選蛋白。崔宇超（2014）根據VP2蛋白成功構建高效的PPV納米PCR檢測方法，并表明其比普通PCR更加敏感，比熒光定量PCR更加方便快捷。臨床上，在PPV感染初期或者后期病毒載量較低時，應用納米PCR檢測PPV能夠更加高效，重要的一點是該方法適合于基層實驗室的使用。

2.2 新型納米級吸附劑

史瑩華等（2005）應用納米技術構建了專性高效吸附黃曲霉毒素的納米級硅酸鹽結構微粒（NSP），通過體外和體內試驗2個方面研究了NSP對黃曲霉毒素（AF）的吸附，并比較了NSP和普通硅酸鹽（SP）的吸附效果，結果表明在黃曲霉毒素污染的日糧（0.l mg/ kg的 AF）中，添加0.3%的NSP，可以極顯著地降低黃曲霉毒素在豬肌肉、肝、腎等組織中的殘留量；添加0.3% 的SP，有降低豬體組織中黃曲霉毒素殘留量的趨勢，但效果不明顯。NSP之所以具有吸附黃曲霉毒素的顯著性能，主要歸因于其能選擇性吸附和固定動物胃腸道食糜中的黃曲霉毒素，形成穩定的復合體，使之從糞便中排出體外。作為一種新型納米級吸附劑，NSP的應用無疑為當前生產中普遍存在的黃曲霉毒素污染問題找到了理想、可行的對策，為生產安全的動物產品開辟了一條新途徑，為打破動物產品國際貿易中黃曲霉毒素殘留限量的技術壁壘提供了科技支撐。

2.3 新型納米飼料添加劑

史瑩華等（2007）以生長肥育豬為試驗對象，研究了其構建的特異性高效吸附黃曲霉毒素B1的新型納米飼料添加劑—蒙脫石納米復合物（MN）緩解豬黃曲霉毒素中毒癥、降低豬體組織中黃曲霉毒素B1殘留量的效果。結果表明在黃曲霉毒素B1污染的日糧中添加0.3%的MN，顯著降低了黃曲霉毒素B1在豬體組織中的殘留量，明顯改善了試驗豬的生長性能，減輕甚至消除了黃曲霉毒素B1對動物生長性能和肝臟功能等的不良影響。這為納米級新型飼料添加劑的開發研制奠定了理論基礎。

2.4 新型抗病毒材料

銀納米顆粒是運用納米技術將銀元素納米化后形成的尺寸在1～100 nm的銀原子團族，有穩定的化學和物理性能。近年來，銀納米顆粒由于具有優良的抗微生物特性，已逐漸成為人們關注的熱點。呂曉楠（2014）以豬傳染性胃腸炎作為冠狀病毒模型，從細胞水平評價了3種不同的銀納米材料對豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）感染宿主細胞及介導的細胞凋亡的抑制效果。結果表明銀納米材料可有效地抑制TGEV感染細胞，其作用機制是通過滅活病毒亦或阻斷病毒侵入細胞。不同質量濃度聚乙烯吡咯烷酮（PVP）表面修飾的銀納米材料具有的抗病毒效果各不相同，這為開發新型抗冠狀病毒藥物提供了新思路。

2.5 免疫增強劑

納米硒具有較強的低毒高效優勢。在生物功效方面，納米硒體外清除羥自由基效率為無機硒的5倍，為有機硒的2.5倍。納米硒對小鼠免疫系統的保護研究已經取得了較理想的結果。武梅等（2005）應用PLGA納米顆粒包裹pUC18-CpG，研究了陽離子PLGA納米顆粒和脂質體包裹后的pUC18-CpG對豬副傷寒疫苗接種小鼠免疫系統的體液和細胞免疫應答反應的影響，證明PLGA納米顆粒包裝能顯著提高裸CpG質粒的免疫增強活性。陳建林等（2009）制備了包裹豬融合基因PIL-46和CpG基序的真核表達質粒的殼聚糖納米顆粒，首次開展了豬IL-4和IL-6融合基因和CpG基序協同調節豬對豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）疫苗免疫應答的研究，結果表明 PIL-46基因和CpG基序經殼聚糖納米顆粒分子包裝后接種實驗豬，能夠顯著增強豬特異抗PRRS體液和細胞免疫應答水平，有效提高接種動物的抗病毒感染能力，促進PRRS的免疫防治。李棟等（2011）研究認為由殼聚糖納米顆粒（CNP）包裹重組分泌型VR1020質粒（VPIL6C）是豬瘟特異性免疫應答的新型有效免疫增強佐劑。所有這些納米級顆粒為研制高效安全和效應持久的新型豬用分子免疫制劑增強劑奠定了基礎，在加強豬抗傳染病的免疫保護中具有廣闊的應用潛力。

2.6 納米佐劑

用納米顆粒做成的免疫佐劑叫納米佐劑。納米佐劑具有特殊的吸收、吸附、控釋和緩釋性能，具有常規佐劑不可比擬的優勢。納米佐劑包括無機納米佐劑和有機納米佐劑。無機納米佐劑包括納米氫氧化鋁、磷酸鈣等；有機納米佐劑包括殼聚糖及其衍生物、PLGA、蜂膠等。

PRRS在世界范圍內的豬場廣泛流行， PRRSV的快速遺傳突變使現有疫苗無法抵抗新出現病毒株。Li等（2013）評價了多肽納米纖維水凝膠（H9e）作為PRRSV改性活病毒（MLV）疫苗佐劑的效果。用茵格發PRRSV-MLV疫苗或用H9e免疫佐劑處理的茵格發PRRSV-MLV疫苗免疫豬，然后接種PRRSV父母疫苗株或遺傳變異株。結果表明，H9e與PRRSV-MLV疫苗聯合使用，能通過改變體液免疫和細胞免疫反應來增強抵抗兩種PRRSV病毒株的疫苗效力。

口蹄疫病毒（FMDV）感染偶蹄動物和人引起人畜共患病。楊帆帆（2010）通過機械球磨法將常規粒徑的藥用活性炭加工成納米活性炭，通過觀察納米活性炭作為豬口蹄疫O型多肽疫苗的佐劑效果，結果表明納米活性炭在體外雖存在緩釋作用，但是其作為佐劑并沒有達到預期的緩釋和免疫增強效果。王剛（2010）以牛IL-6基因作為黏膜分子佐劑，吸附殼聚糖PLGA納米微球載口蹄疫DNA疫苗通過鼻免疫豚鼠，結果表明能夠促進口蹄疫DNA疫苗黏膜免疫。王永林等[3]（2010）采用新型納米佐劑按照不同比例配制口蹄疫O型、AsiaⅠ型雙價滅活疫苗，對疫苗的各項指標進行測定，結果表明新型佐劑疫苗黏度低、易注射、穩定性好、安全、免疫副反應小、免疫效果好。唐冬梅等（2015）成功構建了以多層磷酸鈣納米顆粒為載體的O型FMDV VP1和VP2基因重組質粒，為O型口蹄疫新型重組基因疫苗的進一步研究奠定了基礎。

豬鏈球菌病對養豬業發展造成極大危害，其中豬鏈球菌2型（SS2）為人畜共患傳染病，嚴重威脅公共衛生安全。韓芳（2013）以三聚磷酸鈉為交聯劑，采用離子交聯法制備載IgY殼聚糖納米微粒，采用響應面法優化載IgY殼聚糖納米微粒的制備工藝，體外釋放性能研究結果表明，載IgY殼聚糖納米微粒具有良好的緩釋性能，其在預防和治療豬鏈球菌病方面，將具有廣闊的應用前景。殼聚糖是一種陽離子多聚糖，來源于甲殼類動物外殼中的甲殼質，是自然界中惟一含游離氨基堿性基的可食性動物纖維，它具有良好的生物相溶性和低毒性及促滲作用，可通過多種方法與抗原分子結合，形成納米顆粒。殼聚糖納米顆粒理化特性穩定，且免疫途徑多樣，具有較好的應用前景。

豬支原體肺炎（MPS），又稱豬喘氣病，是一種呼吸道飛沫性傳染病。趙卓等[4]（2009）借助6035納米佐劑，以改變豬支原體肺炎凍干疫苗的免疫途徑，將胸腔注射改為肌肉注射，不僅確保疫苗發揮原有的免疫功效，而且很大程度上可增強疫苗的免疫效果，肺炎減少率均達到80%以上。6035納米佐劑是采用特殊工藝技術制備的一種新型納米顆粒佐劑，佐劑中含有免疫增強劑和免疫緩釋劑，既可增強藥物靶向性，增強疫苗免疫活性，又以延長疫苗的免疫期。

李萍等（2012）研制了一種基于天然多糖納米凝膠（AP-SS）的新型疫苗佐劑。這種納米凝膠的主要成分是海藻酸鈉，一種存在于褐藻細胞壁中的天然多糖。AP-SS可作為一種安全高效的疫苗載體和佐劑，全面提高疫苗誘導的細胞免疫和體液免疫。李樹鵬（2012）以納米乳給藥系統為載體，對中藥黃芪多糖進行劑型改造，研制出黃芪多糖納米乳（APS-NE）給藥系統。納米乳是目前研究較多的一種疫苗佐劑。它是一個由油、水、表面活性劑、助表面活性劑4個組分組成的、粒徑在10～100 nm范圍、液滴多為球形，大小均勻，透明或半透明、具熱力學穩定和各向同性、熱壓滅菌和高速離心穩定，不分層的膠體分散系統。納米乳作為一種新型藥物載體，具有眾多其他藥物載體無可比擬的優點，使其在藥劑學領域中顯示出誘人的發展前景，應用日益廣泛。

趙卓等（2008）分別采用新型納米佐劑和傳統白油佐劑配制豬偽狂犬病滅活疫苗，對兩組疫苗進行各項指標測定，結果表明新型納米佐劑疫苗具有穩定性高，黏度低，吸收良好，免疫副反應小等優點，免疫增強效果明顯優于白油佐劑。郭沛等[5]（2012）研究了納米磷酸鈣（NCaP）作為豬瘟多肽疫苗佐劑的可行性，其利用豬瘟多肽疫苗作為抗原，制備納米磷酸鈣吸附豬瘟多肽疫苗。結果表明，NCaP作為佐劑相對游離豬瘟多肽可提高其免疫效果。徐衛松等（2014）研究表明以納米二氧化硅為佐劑制備的豬傳染性胃腸炎（TGE）滅活疫苗能顯著提高機體的免疫水平，并能刺激機體更快地產生有效抗體，且抗體水平持續時間較長，并能在一定程度上增強豬傳染性胃腸炎滅活疫苗的細胞免疫強度，具有較好的免疫保護效果。寇亞楠等[6]（2015）研究認為以納米鋁膠為佐劑制備的豬細小病毒滅活疫苗，能顯著提高機體的免疫水平，并較早刺激機體產生抗體，具有較好的免疫保護效果。

2.7 納米顆粒疫苗

近年來，通過化學或基因方法修飾過的病毒納米顆粒作為潛在的優秀載體運輸工具和免疫增強劑已被廣泛應用到多個方面[7]。采用納米技術所制成的攜帶各種疫苗并能精確釋放的微芯片或是包裹、表面結合疫苗的納米粒子只要一次性植入畜禽體內，就可終身對各種傳染病產生免疫。不但可以避免現行因多次免疫接種給機體造成的應激而給生產帶來損失，而且大大提高了免疫效果，徹底改變了現行免疫方法的程序。納米顆粒疫苗不僅能夠提高抗原的穩定性、增強抗原的遞呈和免疫原性，同時也能夠靶向性遞呈抗原和緩慢釋放。張建遠（2009）成功構建了豬圓環病毒2型（PCV2）核酸疫苗，并使用殼聚糖對核酸疫苗進行了包被，為研制新型、高效、安全的PCV2核酸疫苗及測定評價豬細胞因子分子免疫佐劑提供了理論依據。歐陽康（2013）首次將荊豆凝集素（UEA）與二乙烯亞胺（BEI）滅活的PRRSV病毒抗原包埋到PLGA納米顆粒中制成疫苗，結果顯示同時包埋UEA與抗原的PLGA納米顆粒疫苗比單獨只包埋抗原的效果好。

3 前景與展望

納米顆粒技術是一門具有廣闊前景的新興技術，納米技術與免疫技術相結合的產物—納米佐劑已成為了當前疫苗研究的熱點。利用不同形式的納米佐劑可以通過多種途徑提高腫瘤疫苗的免疫效應和治療效果。納米佐劑作為疫苗遞送系統能夠模擬病原體的一些關鍵特征，如大小、形狀、表面性質等，從而激發機體的免疫功能。目前對納米佐劑的研究已經取得了一定的成果，但大多數還處于試驗階段，還存在許多問題沒有解決，如很難合成具有物理性質一致的納米顆粒，缺乏對納米顆粒的物理性質是如何影響其生物分布和定位的基本認識，以及這些特性如何影響它們與生物系統之間的相互作用等，離臨床應用還有一定的差距[8]。但是，隨著納米生物技術的發展和研究的深入，借助生物納米材料為疫苗載體和佐劑系統的研制提供的契機和思路，相信開發更加高效、安全、穩定的獸用新型疫苗和疫苗佐劑將指日可待。

參考文獻

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[3] 王永林，武勇，趙卓，等. 新型納米佐劑用于口蹄疫O 型、Asia Ⅰ型雙價滅活疫苗的研究[J]. 中國畜牧獸醫，2010，37（5）：236-238.

[4] 趙卓，潘延缽，張海玲，等. 6035納米佐劑對豬支原體肺炎活疫苗免疫效果的影響[J]. 中國獸醫雜志，2009，45（9）：45-46.

[5] 郭沛，王霄旸，薛飛群，等. 納米磷酸鈣作為豬瘟多肽疫苗佐劑的研究[J].中國動物傳染病學報，2012，20（6）：63-67.

[6] 寇亞楠，劉石，王瑞寧，等. 納米鋁膠佐劑增強豬細小病毒滅活疫苗豬體免疫的效果[J]. 中國獸醫學報，2015，35（1）：25-30.

[7] 李凱，張金玲，王倩，等. 病毒納米顆粒在醫學領域的潛在應用[J]. 生物醫學工程學雜志，2014，31（3）：718-722.

[8] 李鵬，郭軍慶，李清州，等. 納米顆粒疫苗研究進展[J]. 河南農業科學，2014，43（4）：21-25.

收稿日期：（2015-07-22）

作者簡介：莊金秋（1978-），女，山東濰坊人，獸醫碩士，副研究員，主要從事細胞培養和動物用病毒疫苗研制。

基金項目：山東省重點研發計劃項目（2015GSF121027）；山東省現代農業產業技術體系生豬產業創新團隊項目（SDAIT-06-022-15）