熒光PCR法在手足口病腸道病毒EV71型臨床診斷中的意義

柴保山（河南省焦作市第三人民醫院感染四科，河南 焦作 454000）

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熒光PCR法在手足口病腸道病毒EV71型臨床診斷中的意義

柴保山
（河南省焦作市第三人民醫院感染四科，河南 焦作 454000）

【摘要】目的 利用實時熒光PCR檢測EV71型腸道病毒，了解焦作地區手足口病流行趨勢，并提供防治依據。方法 采集2014年4月9日至12月16日焦作地區手足口病患兒肛門拭子407例標本，用實時熒光PCR方法對腸道病毒進行核酸檢測。結果 檢出腸道病毒EV71 型341例，CoXA16型26例型，腸道病毒通用型40例。結論 2014年4月至12月焦作地區手足口病以腸道病毒EV71型為主。實時熒光PCR技術可以對手足口病的治療及疫情的有效控制提供有力的病原學支持。

【關鍵詞】手足口病；腸道病毒EV71；柯薩奇病毒A組16型；實時熒光PCR

手足口病（hand-foot-mouth disease，HFMD）是嬰幼兒常見傳染病，多數患者癥狀輕微，以發熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要癥狀，少數病情較重者可并發無菌性腦（膜）炎、心肌炎等，個別重癥病情進展快，易發生死亡。其主要病原體是腸道病毒，尤其是由EV71引發的［1］，病情兇險，病死率較高。因此，宜采用高效、快速、準確的方法進行檢測。熒光PCR技術特異性強、靈敏快速，能有效縮短檢測時間，對手足口病的治療及疫情的有效控制提供有力的病原學支持。現將研究成果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料。①樣本采集：2014年4月9日至12月16日手足口病407例。每例采集肛門拭子標本1份并裝在3 mL生理鹽水采樣管中，及時送實驗室檢測。②儀器設備：美國ABI公司的7500型實時熒光定量PCR儀；江蘇默樂生物科技有限公司的EV71、CoXAl6及通用型腸道病毒核酸檢測試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取：使用通用型腸道病毒RNA檢測試劑盒對所有樣本進行RNA檢測。檢測過程嚴格按照試劑盒說明書進行操作，首先對樣本進行RNA提取后，將所得到的RNA樣本進行熒光PCR檢測。其判斷標準為：EV71病毒Ct值＜35.29并且稱典型擴增曲線的為陽性，當Ct值＞38.46時結果為陰性；CA16病毒監測時，Ct值需＜35.86且具有典型擴增曲線的為陽性，其值＞38.64時為陰性；腸道病毒的Ct值＜35.62并且具有典型擴增曲線的即為陽性，Ct值＞38.16時，結果為陰性。當Ct值介于二者之間時，需進行二次復檢，如結果仍然在這個區間，則為陽性［2］。

1.2.2 實時熒光PCR反應：EV71、CoXA16及通用型腸道病毒核酸檢測試劑盒說明書操作：①PCR反應體系：反應體系總容積為20 μL，內含EV71（CoXAl6）RT-PCR buffer 12.5 μL，Taq酶0.5 μL，RT酶0.5 μL，EV引物探針6.5 μL。②探針檢測模式設置為：VIC/HEX熒光選擇VIC，將Quencher欄和Passive Reference欄選none。③PCR反應條件：45 ℃15 min逆轉錄，1個循環；95 ℃變性2 min，1個循環；94 ℃10 s'——58 ℃40 s'，40個循環。④在系統成立，即陰陽性參考均正常的條件下，按試劑公司所給的參考值進行結果分析。

2 結 果

病毒核酸檢測結果：應用熒光PCR的方法，對407例臨床樣本進行病毒核酸的檢測，其結果顯示本次監測樣本407例中，陽性率為100%。EV71型341例，占83.7%；CoXA16型26例，占6.3%；通用型6例，占9.8%。以腸道病毒EV71型為主，這與國內多個省市手足口病的流行趨勢相符。診斷參照衛生部《腸道病毒71型（EV71）感染重癥病例臨床救治專家共識（2011年版）》，均符合手足口病的癥狀。

3 討 論

近年來，我國每年都有大量嬰幼兒患手足口病，多表現為口痛、厭食、手足及口腔內出現皰疹或潰瘍，多數患兒可在一周左右痊愈，但是也有部分兒童會引起心肌炎、肺水腫及腦膜炎等并發癥［3］，個別重癥兒童由于病情發展迅速而死亡。目前臨床上尚無對癥治療藥物。

目前我國針對手足口病主要采取早診斷、早隔離、早治療的臨床方案，在診斷時，以觀察臨床表現為主要手段，采用傳統的分離病毒再進行血清中和試驗的方式來進行定型，通常過程需要7～8 h，嚴重耽誤了病情的治療。隨著醫療技術的發展，分子診斷技術目前已經在臨床中得到了廣泛的應用。

通過研究結果表明，熒光PCR技術可以有效的滿足目前手足口病的前期診斷工作需要，其在解決了產物污染導致假陽性問題的同時，還可以通過熒光強度進行精確的定量，使得監測的靈活度和靈敏度都有著明顯提高［4-6］。使用熒光PCR法進行手足口病的監測，從標本處理到結果只需要3～4 h，極大的節約了觀察

熒光PCR技術，實行完全閉管式操作，不僅能大大減少擴增產物污染的機會，且較常規RT-PCR，無論從敏感性、特異性與速度上都更具有優勢。本院通過熒光實時PCR及時病原確診并給予了正確的治療，手足口病重癥只有1例死亡，病死率明顯降低。鑒于此，本研究認為熒光實時PCR在手足口病的檢測中值得推廣和應用。

參考文獻

［1］ 鳴榮，鄧皓輝.陳志鳳，等.廣東東莞市兒童手足口病502例臨床分析［J］.新醫學，2008，39（12）：792-794.

［2］ 高騫，劉文恩，劉元元，等.熒光PCR法檢測手足口病病原體及其臨床意義［J］.中華醫院感染學雜志，2011，21（24）：5323-5325.

［3］ 吳旭耀，沈彩燕，李成，等.手足口病患兒EV71的檢測與其臨床分析［J］.中華醫院感染學雜志，2010，20（24）：3894-3896.

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［5］ 陳勉喬，于浩洋，盧秋梅，等.EV71-CA16腸道病毒熒光定量RTPCR診斷試劑盒的研制［J］.現代檢驗醫學雜志，2015，30（6）：27-31.

［6］ 徐昌平，鄭春紅，嚴菊英，等.EV71、CA16和腸道病毒通用型三重熒光RT-PCR 檢測技術的建立［J］.浙江預防醫學，2016，28（3）：217-220.

中圖分類號：R725.1

文獻標識碼：B

文章編號：1671-8194（2016）17-0038-01