應用PCR-RFLP檢測老年靜脈血栓人群凝血酶原基因突變

曲兆潔　金　峰　史　磊　張　靜　梁　迪

(吉林大學藥學院，吉林　長春　130021)

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應用PCR-RFLP檢測老年靜脈血栓人群凝血酶原基因突變

曲兆潔金峰1史磊1張靜1梁迪

(吉林大學藥學院，吉林長春130021)

摘要〔〕目的探討漢族健康人群和老年靜脈血栓病患者中G20210A突變的發生率。方法應用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)分析技術對某地區72例健康個體和43例老年靜脈血栓患者進行G20210A基因突變研究分析。結果漢族健康個體和老年靜脈血栓患者均未檢出G20210A基因突變類型包括純合子和雜合子。結論G20210A突變可能不是某地區漢族健康人群和老年靜脈血栓病患者發病的主要危險因素。

關鍵詞〔〕凝血酶原基因;突變;檢測

1吉林大學第二臨床醫院

第一作者：曲兆潔(1991-)，女，在讀碩士，主要從事天然藥物化學研究。

凝血酶原基因中5'上游區和3'下游區為非編碼區，對凝血酶原基因的表達起調控作用〔1〕。凝血酶原G20210A突變導致凝血酶原水平升高，造成血液高凝引起血栓〔2〕，如靜脈血栓栓塞癥(VTE)中的深靜脈血栓(DVT)和肺血栓栓塞癥(PTE)。本研究應用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP技術)對某地區72例漢族健康人和43例老年靜脈血栓病人進行了G20210A基因突變的研究分析。

1資料與方法

1.1研究對象隨機抽取72例某地區無血緣關系的漢族健康人群靜脈血1 ml，加乙二胺四乙酸(EDTA)K2抗凝，充分混勻后放入-20℃冰箱冷藏室保存。其中男42例，女30例，年齡30～62歲。另從我院收住的老年靜脈血栓患者43例中抽取靜脈血1 ml，同上處理，其中男22例，女21例，年齡50～74歲。

1.2主要儀器及試劑PCR儀，pros型，德國Eppendorf公司;凝膠成像分析系統，Gel Doc XR型，美國伯樂BIO-RAD公司；小型臺式離心機Sigma1-14型，德國Sigma公司；血液基因組提取試劑盒(DP318)，購自天根生化科技(北京)有限公司，TaKaRa TaqTMHS Perfect Mix及HindⅢ內切酶均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3DNA的提取取冷藏保存的抗凝全血200 μl于1.5 ml離心管中，加入20 μl Proteinase K溶液，混勻，然后按試劑盒說明書進行操作，最后將DNA溶液收集到離心管中備用。

1.4PCR擴增參照文獻〔3〕設計合成引物:上游引物5'- GCACAGACGGCTGTTCTCTT-3';下游引物:5'-ATAGCACTGGGAGCATTGAAGC-3'，PCR擴增反應體系為25 μl，其中DNA模板1 μl，2× mix 12.5 μl，上游引物0.5 μl，primer下游引物0.5 μl，補充ddH2O至25 μl。PCR擴增條件:95℃預變性1 min，95℃變性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共33個循環，最后72℃ 延伸5 min。PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并置凝膠成像儀上觀察特異性條帶，正常PCR擴增產物大小為506 bp，并記錄實驗結果。

1.5PCR-RFLP分析取上述成功擴增的PCR產物10 μl，10倍 Buffer:2 μl，Hind Ⅲ 限制性核酸內切酶1 μl，反應總體積20 μl，37℃酶切1 h后終止。用2%瓊脂糖凝膠進行電泳，并于凝膠成像儀下觀察酶切結果。

2結果

正常情況下的506 bp的PCR擴增片段中存在1個Hind Ⅲ限制性核酸內切酶的酶切位點，可將該片段切成407、99 bp兩個片段(野生型)。若凝血酶原G20210A基因發生G→A突變，則出現一個新的Hind Ⅲ限制性核酸內切酶酶切位點，其中407 bp片段又被切成384、23 bp兩個片段:故若為突變純合子，則出現384、99、23 bp三條電泳條帶:若為突變雜合子，則出現407、384、99、23 bp四條電泳條帶。本實驗分析結果顯示:這72例漢族健康人群中凝血酶原G20210A基因均無該突變類型。結果表明該群漢族健康人無明顯的差異，凝血酶原G20210A基因突變的發生率均為0。同樣對血栓病患者的PCR產物以及經Hind Ⅲ限制性核酸內切酶酶切后的電泳圖表明這43例老年血栓病人群也無明顯的差異，凝血酶原G20210A基因突變的發生率也為0。部分樣本電泳結果。見圖1。

1～5:漢族健康人PCR 擴增產物;6～10為老年血栓病人PCR擴增產物；11～15為健康人PCR酶切產物，16～20為老年血栓病人PCR酶切產物；M為標準分子量Marker圖1　PCR產物及經Hind Ⅲ 限制性核酸內切酶酶切凝膠電泳

3討論

凝血酶原基因G20210A突變是遺傳性易栓癥領域在分子生物學研究中的一個重大發現〔4〕。Poort等〔2〕認為G20210A等位基因突變可使靜脈血栓形成的危險性增加約3倍。Makris等〔5〕發現，凝血酶原G20210A等位基因在正常個體中的流行性僅0.66%，而有靜脈血栓形成史者凝血酶原基因G20210A突變的發生率為7.9%。目前不同研究者得出G20210A基因突變發生率結果不同，可能因選擇的研究人群不同所致。Zalavras等〔6〕研究發現G20210A突變使下肢DVT形成的風險性增加了2.7倍。Arruda等〔7〕研究結果認為凝血酶原基因G20210A突變可增加年輕女性心肌梗死發病的風險。

但凝血酶原基因G20210A突變是歐洲人群血栓性疾病的重要致病因素，國內研究結果未能證實這種相關性〔8〕。郭辰紅等〔9〕關于凝血酶原基因G20210A突變與下肢DVT形成相關性研究中，發現86 例下肢DVT形成患者和100 例健康者中均未發現凝血酶原基因G20210A突變，該基因突變可能不是中國漢族人群下肢DVT的主要危險因子。本研究提示凝血酶原基因G20210A 突變可能與中國人VTE 發生關系不大，但由于該研究在中國的研究報道較少，這項研究的樣本量不夠大，因此還有待于進一步研究。血栓性疾病的形成與遺傳性、后天獲得性因素及環境密切相關〔10〕，因此，研究中國不同地區、不同民族群體中G20210A突變的存在情況，對于從分子水平闡明VTE發生的致病機制具有一定現實意義。

參考文獻4

1Sandra A,Pagano RE.Phospholipid asymmetry in LM cell plasma membrane derivatives:polar head group and acyl chain distributions 〔J〕.Biochemistry,1978;17(2):332-8.

2Poort SR,Rosendaal FR,Reitsma PH,etal.A common genetic variation in the 3’-untranslated region of the prothrombin gene is associated with elevated plasma prothrombin levels and an increase in venous thrombosis〔J〕.Blood,1996;88(10):3698-703.

3Huber S,McMaster KJ,Voelkerding KV.Analytical evaluation of primer engineered multiplex polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism for detection of factor V leiden and prothrombin G20210A 〔J〕.J Mol Diagn,2000;2(3):153-7.

4朱峰.遺傳性易栓癥中凝血酶原基因G20210A突變研究進展〔J〕.中華實用診斷與治療雜志,2013;27(9):833-4.

5Makris M,Preston FE,Beauchamp NJ,etal.Co-inheritance of the 20210 aallele of the prothrombin gene increases the risk of thrombosis in subjects with familial thrombophilia 〔J〕.Thromb Haemost,1997;78(1):1426-9.

6Zalavras C,Giotopoulou S,Dokou E,etal.Prevalence of the G20210A prothrombin gene mutation in Northwestern Greece and association with venous thromboembolism 〔J〕.Int Angiol,2003;22(1):55-7.

7Arruda VR,Siquirea LH,Chiaparini LC,etal.Prevalence of the prothrombin gene variant 20210G→A among patients with myocardial infarction〔J〕.Cardiovasc Res,1998;37(1):42-5.

8魏旭倩，康懿，陳衛賓,等.上海地區人群抗凝蛋白C 基因突變和多態性研究〔J〕.臨床輸血與檢驗，2013;15(1)：34-7.

9郭辰紅，郭瓊行，龔瑤琴，等.凝血因子 V 基因 Leiden 突變和凝血酶原基因 G20210A 突變與下肢深靜脈血栓形成關系的探討〔J〕.山東大學學報(醫學版)，2002;40(3):235-7.

10張佳,趙鳳芹,譚平.凝血酶原基因 G20210A 突變與靜脈血栓栓塞癥相關性的研究進展〔J〕.中國老年學雜志,2013;33(17):4361-4.

〔2014-11-22修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者：梁迪(1979-)，男，博士，講師，主要從事藥物合成研究。

中圖分類號〔〕R543.6〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)21-6074-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.030