蛋白質組學在中醫(yī)藥高血壓領域研究的進展*

李開言,王　軍

(河南省中醫(yī)藥研究院中藥所，河南 鄭州 450004)

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蛋白質組學在中醫(yī)藥高血壓領域研究的進展*

李開言,王軍

(河南省中醫(yī)藥研究院中藥所，河南 鄭州 450004)

摘要蛋白質組學從整體上研究生物體或組織、器官內全部蛋白質結構和功能，與中醫(yī)基礎理論的整體性和系統(tǒng)性不謀而合。高血壓某一階段病理變化的“證”，可能與機體在某一特定環(huán)境下所表達的蛋白質組存在必然聯(lián)系。因此，蛋白質組學研究中醫(yī)中藥治療高血壓具有高效解碼癥候生物學基礎的潛力，將是揭示“證”實質的有效手段。

關鍵詞蛋白質組學；高血壓；中醫(yī)中藥；研究進展；綜述

傳統(tǒng)的高血壓研究是從單個作用機制入手，即先假設某種作用機制對高血壓有影響，如腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)[1]或交感神經(jīng)系統(tǒng)[2]，驗證后再進一步研究具體的作用機制。然而高血壓是多因素、多靶點造成的結果，基于大量分子全面的研究是現(xiàn)代高血壓的研究思路，如蛋白質組學，然后再分析具體的作用機制和致病機制[3]。中醫(yī)學認為，生物機體與自然環(huán)境、五臟、六腑、五官這些不同層次的系統(tǒng)是統(tǒng)一的整體，研究每一部分時，都應探討其與其他機體元素、各種外界條件之間的內在關系和內外聯(lián)系，由此建立一種全面而深刻的認識和關系規(guī)律。而最先由Marc Wilkins提出的蛋白質組學[4]，從整體上研究生物體或組織器官內全部蛋白質結構和功能，與中醫(yī)基礎理論的整體性和系統(tǒng)性不謀而合[5]。高血壓某一階段病理變化的“證”，可能與機體在某一特定環(huán)境下所表達的蛋白質組存在必然聯(lián)系[6]，因此，蛋白質組學研究中醫(yī)中藥治療高血壓具有高效解碼癥候生物學基礎的潛力，將是揭示證實質的有效手段。

1蛋白質組學研究方法

蛋白質組學方法包括二維電泳(2-DE)和質譜(MS)[7]。2-DE能夠高度分散蛋白質，但可預見的人類基因有30 000個，而且蛋白修飾和降解也能夠導致蛋白質在膠上位置的轉移，故不能僅靠蛋白質在膠上的位置來辨別蛋白。蛋白質的后續(xù)分析通過準確性和靈敏度高的MS分析進行。MS分析主要有兩種離子化技術：基質輔助激光解析飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)和電噴霧質譜(ESI-MS)。MALDI-TOF-MS即使分析分子量大于100 000 kDa的大分子，時間也不超過1ms。而ESI-MS通過電噴射電離或噴霧器直接蒸發(fā)樣本，常與液相(LC)聯(lián)用，而LC分離步驟通常在檢測之前應用。ESI-MS能夠提供比MALDI-TOF-MS更可靠的蛋白鑒定。適合MS檢測的銀染，金屬螯合物染色或熒光染色是復雜樣品分析最佳的染色方法[8]。相比銀染，熒光染色提供了更寬動態(tài)和線性定量范圍的檢測[9]。蛋白質分子可以在被分離前共價結合熒光分子或電泳后再結合熒光染料。不同的樣本用不同的熒光標記后可以在同一個2-DE膠上電泳，從而對不同樣本進行直接對照，避免膠與膠之間固有變化的影響。常用的商業(yè)染料是Cy3和Cy5熒光染料[10]，兩者分子量幾乎相同，蛋白質被標記后電泳遷移率幾乎不受影響。

除了2-DE/MS，近來也發(fā)展了其他蛋白質組學平臺，如非膠鳥槍蛋白質組學技術[11-12]，使用LC分離，自動串聯(lián)MS分析，這種方法又叫做多維蛋白鑒別技術。該技術用于鑒別復雜混合物中用二維電泳難以鑒別的蛋白，包括基本的、高度疏水或極端分子量蛋白質。DELLES C[13]等用毛細管電泳與串聯(lián)質譜合用，這種方法分辨率高、快速、可靠、可重復且價錢合理，能夠分析包含數(shù)千個不同多肽和蛋白的復雜生物體液，適用于臨床高通量分析。非膠分離技術如多維液相和同位素編碼親和標記物(ICAT)法[14]、穩(wěn)定同位素標記、串聯(lián)質量標記和最近的相對和絕對定量的同位素標記(iTRAQ)[15]，可以避免凝膠電泳點跡融合和共遷移的弊端，例如：iTRAQ被用于伯胺，消除對含有半胱氨酸多肽的依賴性。表皮生長因子誘導的磷蛋白質改變通過32P/33P標記的正磷酸鹽而檢測出來[16]。ICAT法可鑒別更高比例的信號蛋白[17]，而iTRAQ可檢測更大比例的核糖體蛋白和轉錄因子。這些方法與樣品分離兼容，可降低蛋白復雜性，允許低豐度蛋白質的測量，而且有利于自動化，定量和全面的蛋白質組學分析，最近被用于大范圍的蛋白質組學研究。

2蛋白質組學應用于中醫(yī)高血壓癥候診斷

近年來，不少學者運用蛋白質組學技術對中醫(yī)高血壓癥候進行診斷。胡小勤等[18]通過蛋白質組學比較了高血壓病氣虛血瘀證和肝陽上亢證患者血清作用于體外培養(yǎng)的內皮細胞的差異蛋白點，發(fā)現(xiàn)差異蛋白有27個，其中11個蛋白上調，16個蛋白下調；說明基于細胞模型的中醫(yī)證候蛋白質組學研究可行，并探討了高血壓同病異證可能的分子機制及其不同點。褚瑜光等[19]對高血壓痰濕壅盛證患者血清蛋白質組學進行研究，采用弱陽離子納米磁性微球捕獲血清中的蛋白質，Ciphergen PBS-Ⅱc型蛋白質芯片閱讀檢測儀繪制成蛋白指紋圖譜，使得差異蛋白點更為直觀。4個蛋白質峰被識別為肝膽濕熱證特異表達的蛋白質，并作為診斷標志，診斷的靈敏性為93.103%，特異性為92%。孫喜穩(wěn)等[20]通過對高血壓血瘀證患者血清致傷人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)進行差異蛋白質組學研究，結果順烏頭酸酶與高血壓血瘀證高度相關。楊波等[21]觀察高血壓腦出血急性期肝陽化風證、恢復期陰虛風動證外周血單個核細胞的蛋白質差異表達變化，發(fā)現(xiàn)高血壓腦出血發(fā)展的不同階段可能與肌動蛋白、纖維蛋白原α鏈前體密切相關。

3蛋白質組學研究中藥治療高血壓的致病機制

最近基因組學相關研究證明高血壓的致病機制與大量基因及其變體有關，因此，可以預期更大數(shù)量的蛋白質在這一進程中具有誘發(fā)高血壓的作用[22]。高血壓可致腎損害。腎臟作為高血壓研究的關鍵器官，以自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)為模型探索高血壓腎臟的氧化應激研究越來越多。WILCOX等[23]認為氧化應激超過人體承受范圍，極有可能引發(fā)高血壓。CHABRASHVIL I等[24]發(fā)現(xiàn)動物高血壓模型中，超氧化物如過氧化物、過氧化氫、氧化應激生物標記物在脈管系統(tǒng)和腎臟中都有所增加。羅珊珊等[25]研究了主治痰濕壅盛型高血壓的半夏白術天麻湯對SHR腎臟蛋白表達的影響，發(fā)現(xiàn)與WKY對比，SHR的銅鋅超氧化物歧化酶、過氧化物酶2等氧化應激蛋白表達量較低，而半夏白術天麻湯能使這些蛋白的表達上調，從而推測：SHR在高血壓病理狀態(tài)下，氧化應激調節(jié)能力降低，引起腎臟損傷；而半夏白術天麻湯使這些蛋白的表達上調，增強了腎組織的抗氧化應激能力，從而調節(jié)血壓。此揭示了半夏白術天麻湯治療高血壓可能的作用機制。后來又通過Western研究明確了半夏白術天麻湯能上調銅鋅超氧化物歧化酶，過氧化物酶2蛋白表達。張鶯等[26]發(fā)現(xiàn)肝陽上亢型高血壓大鼠在附子湯灌胃后，大部分眼結合膜充血，在運用平肝潛陽法治療后，眼結合膜充血較前好轉。用二維凝膠電泳分離平肝潛陽法治療后高血壓肝陽上亢證大鼠的蛋白質組圖譜，經(jīng)基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)和數(shù)據(jù)庫分析：與氧化應激相關的異檸檬酸脫氫酶、類固醇合成急性調節(jié)蛋白在肝陽上亢高血壓大鼠組表達較高血壓組上調，治療后治療組上述指標重新下調至前水平；鐵輕鏈蛋白、Tu翻譯延長因子、鳥苷酸解離抑制因子、黃素還原酶、Basic轉錄因子3在肝陽上亢高血壓大鼠組表達較高血壓組下調，治療后治療組重新上調至前水平，從而推斷平肝潛陽法治療與改善氧化應激及胰島素抵抗有關。

4蛋白質組學的不足和發(fā)展趨勢

蛋白的磷酸化、乙酰化和糖基化等復雜的翻譯后修飾能夠顯著改變蛋白功能，但卻不易被現(xiàn)有的蛋白質組學監(jiān)測到[27-29]，因此，發(fā)展能夠檢測蛋白翻譯后修飾情況的蛋白質組學技術更有利于高血壓的研究。翻譯后修飾也能發(fā)生在活體外，如果一個樣品不立即凍存，就會繼續(xù)進行翻譯后修飾，組織和體液中蛋白酶的豐富性也將改變蛋白質學的種類。在樣本儲存過程中，細菌的過度生長也不是罕見的現(xiàn)象。血清蛋白質組學研究中，不完全離心、溶血和不完全凝血都會引起分析前的錯誤[30]。為了臨床的特殊目的，樣品的處理必須建立嚴格的標準，才能保證蛋白質組學研究的可靠性。

人類高血壓在中年期間發(fā)展緩慢，在步入老年后對心血管相關疾病的發(fā)病率和致死率有很大影響。高血壓成因是多因素、多靶點的，基因對高血壓的發(fā)展有一定作用，環(huán)境因素如高鹽飲食、肥胖和低心血管適應證等對高血壓的發(fā)展也有很大作用。蛋白質表達受基因和環(huán)境的共同作用。蛋白質組學有利于研究基因與環(huán)境之間的相互作用以及環(huán)境對高血壓的作用。運用蛋白質組學研究高血壓的發(fā)病機制，尋找高血壓發(fā)生前及發(fā)生各個階段的生物標記物將對高血壓的預防和診斷有重要意義。

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(編輯陶珠)

文章編號:1001-6910(2016)05-0073-03·綜述·

中圖分類號:R544.1

文獻標志碼:B

doi:10.3969/j.issn.1001-6910.2016.05.35

通信作者：王軍，研究員，wj13513891329@163.com

* 基金項目：國家中醫(yī)藥管理局重點學科建設項目(國中醫(yī)藥發(fā)[2009]30號)；河南省中醫(yī)藥科學研究專項重點課題(2014ZY01021)；河南省中醫(yī)臨床學科領軍人才計劃( 2013-10)

收稿日期：2015-12-16；修回日期：2016-03-09