2種表型試驗檢測葡萄球菌誘導型克林霉素耐藥的評估及基因分析

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2種表型試驗檢測葡萄球菌誘導型克林霉素耐藥的評估及基因分析

葡萄球菌屬中所有的菌種都有較大的潛在致病性，已成為臨床抗感染治療的一大難題[1-2]。1968年有學者報道2例耐紅霉素金黃色葡萄球菌引起的感染，治療前對克林霉素和林可霉素均敏感，但治療后林可霉素卻變為耐藥，于是作者推測克林霉素和林可霉素治療此類菌可能會引起治療無效[3]。大環內酯類(如紅霉素)-林可酰胺類(如克林霉素)-鏈陽霉素B類復合藥物(macrolide-lincosamide-streptogramin B，MLS)為治療葡萄球菌感染的常用藥物[4]，在多數菌屬中，紅霉素一直是較強的誘導劑，具有誘導克林霉素耐藥的作用。因此，如何合理使用MLS已經成為人們關注的焦點[5]。為此，實驗室有必要開展試驗對克林霉素誘導耐藥的菌株進行檢測并報告臨床。為評價MicroScan革蘭陽性復合板(簡稱PC33復合板)檢測葡萄球菌屬誘導型克林霉素耐藥的性能，本研究對醫院分離到的紅霉素耐藥而克林霉素敏感的葡萄球菌以D試驗(雙紙片法檢測克林霉素誘導耐藥試驗)為判斷標準，用PC33復合板進行誘導型克林霉素耐藥檢測，同時通過聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)進一步了解其基因分布情況。

材料和方法

一、材料

1.菌株來源復蘇同濟大學附屬第十人民醫院2013年6月至2014年6月PC33復合板結果為紅霉素耐藥而克林霉素敏感的葡萄球菌(使用Walkaway 96 plus全自動微生物鑒定和藥物敏感性分析儀)共115株，其中金黃色葡萄球菌31株、凝固酶陰性葡萄球菌84株。從同一患者同一部位多次分離的相同菌株按1次統計。菌株均來自同濟大學附屬第十人民醫院住院和門診患者送檢的樣本,包括痰液、咽拭子、尿液、膿液、分泌物、血液、透析液等。質控菌株：金黃色葡萄球菌(ATCC 29213)作為PC33復合板的質控菌株，金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)作為紙片擴散法藥物敏感性試驗的質控菌株。

2.培養基及藥物敏感性紙片水解酪蛋白胨瓊脂培養基為上海伊華生物公司產品；紅霉素(15 μg/片)、克林霉素(2 μg/片)為英國Oxoid公司產品。

3.試劑與儀器DNA抽提試劑盒及PCR試劑盒(TaKaRa公司)；2種耐藥基因的PCR引物(上海寶生物公司)；9700型基因擴增儀(美國MJRearch公司)；電泳儀(上海天能公司)；凝膠成像系統(美國伯樂公司)。

二、方法

1.菌株鑒定115株菌株用革蘭染色、凝固酶試驗、西門子Walkaway 96 plus全自動微生物鑒定和藥物敏感性分析儀及其配套的PC33復合板進行鑒定。

2.體外藥物敏感性分析采用PC33復合板聯合孔進行常規鑒定藥物敏感性分析，35 ℃培養16～18 h，觀察含紅霉素和克林霉素聯合孔(含4 μg/mL紅霉素和0.5 μg/mL克林霉素)是否有菌生長來判斷結果。

3.D試驗按照美國臨床實驗室標準化協會(the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)標準進行操作和判讀[6]。挑選在35 ℃有氧環境孵育18～24 h的單個菌落，將0.5麥氏單位的新鮮菌液均勻涂布于水解酪蛋白胨瓊脂平板，在相距15 mm處(邊緣到邊緣)分別貼上紅霉素(15 μg/片)和克林霉素(2 μg/片)紙片。35 ℃有氧環境孵育18～24 h后，按照紅霉素14～22 mm、克林霉素15～20 mm的標準判讀。

4.相關耐藥基因檢測(1)DNA抽提：所有試驗菌株經DNA抽提試劑盒抽提后用PCR擴增試劑盒進行模板制備；(2)引物設計及PCR擴增：PCR引物參考文獻[7]，反應過程見表1；(3)擴增產物分析：PCR產物于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，100 V電泳45 min后紫外光線下觀察結果，置入凝膠成像儀中觀察并記錄結果。在預計位置420 和572 bp處出現條帶，分別為ermA、ermC基因。

表1　引物序列和PCR循環條件

三、統計學方法

采用SPSS 20.0 統計軟件進行數據分析。計數資料以百分率表示，2種方法的結果進行配對χ2檢驗，顯著性檢驗水準α=0.05。同時以D試驗法為判斷標準評估PC33復合板檢測克林霉素誘導耐藥的敏感性及特異性。

結果

一、PC33復合板誘導孔結果及誘導耐藥的檢出率

含紅霉素和克林霉素聯合孔內有菌生長為誘導試驗陽性，不生長為陰性。PC33復合板耐藥檢出率分別為金黃色葡萄球菌61.3%(19/31)、凝固酶陰性葡萄球菌47.6%(40/84)。見表2。

二、D試驗測定誘導耐藥表型結果及誘導耐藥的檢出率

當克林霉素在靠近紅霉素紙片一側出現截平現象，即克林霉素紙片的抑菌環看似大寫的“D”時(稱為“D”抑菌環)提示存在可誘導的克林霉素耐藥，為誘導型MLS(inducible macrolide-lincosamide-streptogramin B，iMLS )耐藥，即D試驗陽性；如果紅霉素和克林霉素均耐藥，則為結構型MLS(constitutive macrolide-lincosamide-streptogramin B，cMLS)耐藥；如果克林霉素抑菌環仍為圓形，為MS表型，即D試驗陰性。見圖1。D試驗耐藥的檢出率分別為金黃色葡萄球菌61.3%(19/31)；凝固酶陰性葡萄球菌51.2%(43/84)。見表2。

三、PC33復合板與D試驗檢測克林霉素誘導耐藥的結果比較

經配對χ2檢驗，2種方法的檢測結果差異無統計學意義(P>0.5)，并以D試驗法為判斷標準評估PC33復合板檢測克林霉素誘導耐藥的敏感性為95.1%，特異性為100.0%；2種表型試驗金黃色葡萄球菌符合率為100.0%，凝固酶陰性葡萄球菌符合率為93.0%。見表2。在115株葡萄球菌中，D試驗結果和PC33復合板誘導孔結果同時陽性59株；D試驗結果陽性而PC33復合板誘導孔結果陰性3株；D試驗結果和PC33復合板誘導孔結果同時陰性53株(其中MS表型29株、cMLS 24株)。

四、erm基因在不同菌株中的分布

檢測ermA、ermC基因，發現cMLS耐藥菌株主要為ermA；iMLS耐藥菌株主要為ermC，見表3。PCR反應產物在瓊脂糖凝膠中電泳，見圖2、圖3。

表2　PC33復合板及D試驗耐藥檢出率

注：(a)為cMLS型；(b)為iMLS型

圖1　克林霉素誘導試驗

注：1為DL2000 Marker; 2、3為陰性樣本；4~8為ermA基因陽性樣本

圖2ermA基因擴增片段電泳圖

注：1為DL2000 Marker； 2~8為ermC基因陽性樣本

圖3ermC基因擴增片段電泳圖

討論

臨床上葡萄球菌引起的醫院感染有所上升，而大環內酯類、林可酰胺類等抗菌藥物由于其組織滲透性強、口服效果好且對腎臟無不良反應等特點被應用于治療該類細菌引起的感染[8]。在患者中發現，克林霉素耐藥情況是高度易變的，如果經常使用，可造成iMLS的漏檢，導致臨床治療失敗，iMLS的耐藥表型是紅霉素耐藥而克林霉素敏感，必須用D試驗才能檢測出來[9]。應用紅霉素和克林霉素紙片進行的D試驗首先由SWENSON等[10]倡導，該方法用于葡萄球菌屬克林霉素誘導耐藥的檢測，操作簡便，結果可靠。但紅霉素和克林霉素的紙片間距對試驗結果有較大影響[11]，2張紙片間距過大可導致假陰性[12]。由于D試驗是用紙片擴散法進行檢測，不適合臨床大量樣本作為常規藥物敏感性試驗。而PC33復合板克林霉素誘導孔使誘導型耐藥檢測實現自動化，簡單易行，準確度高，本研究對其檢測性能進行了評估。115株試驗菌株中，D試驗陽性62株，D試驗耐藥檢出率分別為金黃色葡萄球菌61.3%、凝固酶陰性葡萄球菌51.2%。PC33復合板檢測陽性59株，PC33復合板耐藥檢出率分別為金黃色葡萄球菌61.3%、凝固酶陰性葡萄球菌47.6%。本研究結果表明，以D試驗為判斷標準計算PC33復合板檢測克林霉素誘導耐藥的敏感性為95.1%，特異性為100.0%；2種表型試驗金黃色葡萄球菌符合率為100.0%，凝固酶陰性葡萄球菌符合率為93.0%。2種方法有很好的一致性，這與傅石明[13]的結果基本一致。在紙片法紅霉素與克林霉素同時耐藥的24例中，PC33復合板誘導孔未生長但紅霉素孔耐藥、克林霉素孔敏感，是否與PC33復合板對克林霉素的檢測能力不穩定，或與操作人員處理菌液濃度是否均勻有關，有待進一步研究。

葡萄球菌對大環內酯類耐藥通常有2種機制：一是由msrA基因(僅影響大環內酯類和鏈陽菌素B)或由mefA、mefE基因(僅影響大環內酯類，不影響克林霉素和鏈陽菌素B)介導的主動流出的泵機制，編碼產生外排蛋白導致對大環內酯類和鏈陽霉素B的耐藥，但對克林霉素敏感，這種耐藥表型稱為MS表型，即紅霉素耐藥而克林霉素敏感，這種能量依賴泵能在藥物與核糖體靶位結合前有效地從菌細胞內排出大環內酯類藥物。二是核糖體靶位改變，由各種erm基因編碼的核糖體甲基化酶所介導，核糖體上單個位點發生變化，23S rRNA 上腺嘌呤殘基N6 -二甲基化，導致核糖體構象發生變化，表現為對大多數MLS抗菌藥物耐藥。這種耐藥體外可有2種表型，即cMLS和iMLS。若erm基因穩定表達，則表現對紅霉素、克林霉素和其他MLS群成員耐藥，稱為MLS固有表型，即紅霉素耐藥且克林霉素耐藥，常規的體外藥物敏感性試驗均能測出。然而在某些情況下，基因需藥物誘導劑誘導才能表達對克林霉素耐藥，否則體外可能會表現為對克林霉素敏感，紅霉素可作為這種誘導劑，這些分離菌在體外表現對紅霉素耐藥而對克林霉素敏感，稱為MLS誘導表型,即紅霉素耐藥而克林霉素敏感(誘導耐藥)。目前，在葡萄球菌中發現了3種erm基因，即ermA、ermB和ermC，ermA和ermC比較常見，ermA+ermC是MLS葡萄球菌較為常見的復合基因型，而ermB較少見，主要從動物分離菌株中檢測到。本試驗對ermA、ermC進行了研究。

在115例試驗菌株中，29株MS表型的菌株未檢出任何基因型。12株iMLS耐藥的金黃色葡萄球菌菌株中，8株基因型為ermA，4株基因型為ermC，未檢出同時帶有2種基因的菌株；50株iMLS耐藥的凝固酶陰性葡萄球菌菌株中，11株基因型為ermA，38株基因型為ermC，1株檢出同時帶有2種基因的菌株。11株cMLS耐藥的金黃色葡萄球菌中，8株基因型為ermA，1株基因型為ermC，1株檢出同時帶有2種基因的菌株，1株未檢出任何基因型；10株cMLS耐藥的凝固酶陰性葡萄球菌菌株中，5株基因型為ermA，1株基因型為ermC，2株檢出同時帶有2種基因的菌株，2株未檢出任何基因型。由此可見，PC33復合板對克林霉素誘導型耐藥有較小的漏檢率。本研究中，cMLS耐藥菌株的主要耐藥基因為ermA，iMLS耐藥菌株的主要耐藥基因為ermC,這同喬昀等[14]的報道基本一致。

試驗中3株菌株(其中1株為金黃色葡萄球菌，2株為凝固酶陰性葡萄球菌)未發現以上2種基因的任何1種，其表型為紅霉素和克林霉素均耐藥，耐藥機制是否與攜帶其他基因如ermB、msrA(編碼大環內酯類和鏈陽菌素共同耐藥基因)和msrB基因等有關，有待進一步研究。iMLS型耐藥在臨床上比較多見，主要耐藥基因為ermC，PCR可進行分子流行病學調查。目前臨床微生物實驗室使用PC33復合板進行克林霉素誘導耐藥的檢出率較高，能較好地指導臨床合理使用克林霉素治療。

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(本文編輯：姜敏)

張靜華，袁應華，劉妍，成潔，孫奮勇

(同濟大學附屬第十人民醫院，上海 200072)

摘要：目的評價MicroScan革蘭陽性復合板(簡稱PC33復合板)和D試驗(紅霉素、克林霉素雙紙片法)檢測葡萄球菌誘導型克林霉素耐藥的性能及耐藥基因分析。方法檢測115株PC33復合板檢測結果為紅霉素耐藥而克林霉素敏感的葡萄球菌對紅霉素/克林霉素復合孔的耐藥性，同時用D試驗檢測紅霉素對克林霉素的誘導耐藥表型，用聚合酶鏈反應(PCR)檢測大環內酯類-林可酰胺類-鏈陽霉素B類復合藥物(MLS)的耐藥基因。結果PC33復合板耐藥檢出率分別為金黃色葡萄球菌61.3%、凝固酶陰性葡萄球菌47.6%，D試驗耐藥檢出率分別為金黃色葡萄球菌61.3%、凝固酶陰性葡萄球菌51.2%，2種方法的檢測結果差異無統計學意義(P>0.5)。以D試驗為判斷標準計算PC33復合板檢測克林霉素誘導耐藥的敏感性為95.1%，特異性為100.0%；檢出erm基因常見的結構型MLS(cMLS)耐藥基因ermA和誘導型MLS(iMLS)耐藥基因ermC。結論PC33復合板與D試驗檢測葡萄球菌誘導型克林霉素耐藥的結果有很好的一致性；PC33復合板有較好的臨床應用價值。實驗室應加強克林霉素誘導耐藥的檢測，以指導臨床合理選用抗菌藥物。

關鍵詞：誘導型克林霉素耐藥；葡萄球菌；MicroScan革蘭陽性復合板；D試驗；紅霉素；基因

Drug resistance evaluation and gene analysis on the detection of inducible clindamycin resistance inStaphylococcusby 2 phenotype testsZHANGJinghua，YUANYinghua，LIUYan，CHENGJie,SUNFenyong.(TheTenthPeople′sHospitalofTongjiUniversity，Shanghai200072，China)

Abstract:ObjectiveTo evaluate the drug resistance performance and drug resistance gene on the detection of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus by MicroScan Gram-positive composite plate(PC33 composite plate)and D test(erythromycin and clindamycin double-disk diffusion method). MethodsThe drug resistance of erythromycin/clindamycin composite well of the 115 isolates which were resistant to erythromycin and sensitive to clindamycin by MicroScan automatic identification was determined. Meanwhile， the inducible resistant phenotype of erythromycin to clindamycin was analyzed by D test， and the resistant gene to macrolide-lincosamide-streptogramin B (MLS) was detected by polymerase chain reaction(PCR). ResultsThe detection rates of PC33 composite plate were 61.3% for Staphylococcus aureus and 47.6% for coagulase-negative Staphylococcus. The detection rates of D test were 61.3% for Staphylococcus aureus and 51.2% for coagulase-negative Staphylococcus. The difference between the 2 methods had no statistical significance(P>0.5). Using D test as a standard to evaluate PC33 composite plate resistant to inducible clidamycin resistance， the sensitivity was 95.1%， and the specificity was 100.0%. The predominant gene for constitutive MLB(cMLS) resistance to clindamycin was ermA. The predominant gene for inducible MLS(iMLS)resistance to clindamycin was ermC. ConclusionsThe detection results of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus by MicroScan Gram-positive composite plate show a coincidence with D test. PC33 composite plate has good clinical significance. The detection of inducible clindamycin resistance should be paid attention in laboratories in order to guide physicians to select antimicrobial agents correctly.

Key words:Inducible clindamycin resistance；Staphylococcus；MicroScan Gram-positive composite plate；D test；Erythromycin；Gene

收稿日期：(2014-12-15)

通訊作者：孫奮勇，聯系電話：021-66306909。

作者簡介：張靜華，女，1984年生，學士，技師，主要從事臨床微生物檢驗工作。

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)12-1238-05R446.5

文獻標志碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.12.018