全自動ELISA系統檢測抗線粒體M2抗體及臨床意義

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全自動ELISA系統檢測抗線粒體M2抗體及臨床意義

高滴度的抗線粒體M2抗體是原發性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)的診斷標志性自身抗體。有文獻報道，抗線粒體M2抗體在PBC患者出現臨床癥狀和組織學特征變化之前數年即可出現，其在PBC診斷及疾病預測等方面具有重要價值[1]。有研究已證明，抗線粒體M2抗體的靶抗原主要為線粒體上的2-氧酸脫氫酶復合體(2-oxoacid dehydrogenase complex， 2-OADC)的一些組分，即側鏈2-氧酸脫氫酶復合體E2(E2 subunit of the branched-chain 2-oxoacid dehydrogenase complex， BCOADC-E2)、丙酮酸脫氫酶復合體E2(E2 component of pyruvate dehydrogenase complex， PDC-E2)、2-氧戊二酸脫氫酶復合體E2 (E2 subunit of the oxoglutarate dehydrogenase complex， OGDC-E2)[2-3]。目前，抗線粒體M2抗體的檢測試劑主要針對以上3種靶抗原的組合蛋白，檢測方法以手工酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA)為主，而且沒有統一的單位值。我們從多年的臨床檢驗中發現，該抗體低水平陽性也常常見于其他肝病或其他自身免疫性疾病，給臨床診斷與鑒別診斷帶來困惑。鑒于以上問題，本研究采用全自動ELISA系統對PBC、慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus， HBV)感染者和健康對照組267例樣本進行抗線粒體M2抗體檢測，避免或減少手工操作不規范及其他因素引起的不可靠結果，加強質量管理，以達到輔助臨床診斷和鑒別診斷的目的。

材料和方法

一、研究對象

選取2010年1月至2013年7月于首都醫科大學附屬北京佑安醫院住院患者189例，其中PBC組112例， 男11例，女101例，年齡(56.64±11.57)歲； HBV感染組77例，男56例，女21例，年齡(41.4±13.1)歲。78名來自首都醫科大學附屬北京佑安醫院輸血科的健康獻血員作為健康對照組，男48名，女30名，年齡(33.8±9.7)歲。PBC采用2009年美國肝臟病學會(American Association for the Study of Liver Diseases ， AASLD)推薦的診斷建議[4]。HBV感染者診斷標準符合“慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)”[5]。所有患者早晨空腹采集靜脈血3 mL，1 h內分離血清，-20 ℃保存至檢測。

二、試劑與儀器

1.試劑抗線粒體M2抗體檢測試劑盒(ELISA，上海科新生物技術股份有限公司)。

2.儀器ADC ELISA 400流水線式全自動酶聯免疫工作站(山東艾德康生物有限公司)。

三、方法

2.全自動ELISA系統檢測抗線粒體M2抗體 將試劑和檢測樣本置于全自動酶聯免疫工作站相應的位置。按照試劑盒的操作要求，先將試劑盒平衡至室溫。將待檢血清用樣本稀釋液按1∶200的比例稀釋。加樣本：分別向孔中加入100 μL不同濃度的標準品S1-S5(濃度分別為800、200、100、50和25 RU/mL)、陽性對照品、陰性對照品和稀釋后的待檢血清，加完最后一個樣本后開始計時，室溫溫育30 min。洗板：每孔加入應用洗滌液400 μL，洗滌液在孔中保留1 min，洗滌3次，每孔加酶標抗體工作液100 μL，室溫溫育30 min，重復洗板3次。顯色：將顯色液A、顯色液B以1∶1等體積混合，重復混勻后每孔加入100 μL混合液，混勻，室溫避光顯色15 min，每孔加入50 μL終止液。在終止反應20 min內，于450和630 nm雙波長測量各孔的吸光度(A)值。分別以S1-S5標準品濃度的自然對數和其A值為橫、縱坐標，作標準曲線，并根據標準曲線計算患者血清中的抗體濃度。臨界值為25 RU/mL，線性檢測范圍為25～800 RU/mL。

四、統計學方法

結果

一、全自動ELISA系統檢測抗線粒體M2抗體的精密度評估

批內和天間的不精密度結果見表1。該ELISA系統的批內和天間精密度均較好，CV均≤5%。同時我們評價了該全自動酶聯免疫工作站單通道、多通道針對不同濃度樣本、標準品和不同取樣量的結果均一性，CV均≤5%(具體數據未顯示)。

表1　全自動ELISA系統檢測抗線粒體M2抗體的精密度評估結果

二、抗線粒體M2抗體對PBC診斷的ROC曲線和診斷特性參數

繪制的抗線粒體M2抗體對PBC診斷的ROC曲線見圖1。當臨界值定為25 RU/mL時，敏感性為89.3%，特異性為94.8%，陽性預測值為92.6%，陰性預測值為92.5%，陽性似然比為17.2，陰性似然比為0.11，曲線下面積為0.980，故認可試劑生產商提供的抗線粒體M2抗體的陽性判斷限25 RU/mL。

圖1　抗線粒體M2抗體對PBC診斷的ROC曲線

三、抗線粒體M2抗體在不同組別中的分布情況

PBC組抗線粒體M2抗體的陽性率為89.3%(100/112)，抗體濃度>800 RU/mL的比例為63%(71/112)，抗體濃度在25～50 RU/mL的比例為3%(3/112)。HBV感染組抗線粒體M2抗體的陽性率為5.2%(4/77)，4例抗體陽性者中有3例抗體濃度在25～100 RU/mL之間，1例在100 RU/mL以上；健康對照組抗線粒體M2抗體陽性率為5.1%(4/78)，4例抗體陽性者抗體濃度在25～50 RU/mL之間(數值分別為26.6、28.8、34.3和26.5 RU/mL)。見表2和圖2。

表2　抗線粒體M2抗體在不同組別中的陽性率

注：(a)為PBC組；(b)為HBV感染組；(c)為健康對照組

圖2PBC組、HBV感染組和健康對照組抗線粒體M2抗體不同濃度的分布情況

討論

本研究采用全自動ELISA系統，以重組PDC-E2、BCOADC-E2和OGDC-E2的組合蛋白為靶抗原，檢測抗線粒體M2抗體。我們首先對該系統的精密度進行了評估，對不同濃度樣本和標準品進行了檢測，批內和天間的CV均≤5%，精密度較好。抗線粒體M2抗體是PBC患者最為特征性的血清標志物，對PBC具有診斷價值[6-8]。

本研究檢測了112例PBC患者、77例HBV感染者和78名健康對照者血清中的抗線粒體M2抗體，PBC患者抗線粒體M2抗體檢測的陽性率為89.3%，與YANG等[9]報道的陽性率89%一致。PBC患者抗線粒體M2抗體以高滴度為主，抗體濃度>800 RU/mL的比例為63%(71/112)。 本研究中發現4例HBV感染者抗線粒體M2抗體陽性，陽性率為5.2%(4/77)，其中3例抗體濃度值在25～100 RU/mL之間， 1例在110 RU/mL以上，臨床診斷為慢性乙型肝炎合并戊型肝炎，而且此患者抗核抗體低滴度陽性，但是否對抗線粒體M2抗體的檢測有影響，有待進一步研究。健康對照組抗線粒體M2抗體陽性率為5.1%(4/78)，4例抗體陽性者抗體濃度在25～50 RU/mL之間，濃度值分別為26.6、28.8、34.3和26.5 RU/mL，抗體濃度值多集中在25～30 RU/mL。在本研究中對照組為健康獻血員，在獻血時并未檢測抗線粒體M2抗體，也沒有出現任何臨床癥狀和體征。因此，如果偶然發現這種抗體存在，而無臨床表現，應評估該抗體對該個體預后的影響，并結合患者的年齡、性別、臨床其他相關疾病及其他實驗室指標綜合評價。由于抗線粒體M2抗體可出現在臨床表現前，并對疾病具有一定的預測價值，因此必要時可進行定期復診及實驗室指標檢測。

我們從多年的臨床檢驗中發現抗線粒體M2抗體低水平(25～40 RU/mL)陽性也常常見于其他肝病，給臨床診斷與鑒別診斷帶來困惑。可能有以下原因：(1)疾病本身特點；(2)缺乏國際參考物質，目前尚未標準化；(3)檢測項目本身的參考區間是否合適；(4)檢測系統的問題。本研究結果發現在HBV感染者和健康對照者中處于低水平抗線粒體M2抗體陽性的比例約為5%，較手工檢測的比例低，說明全自動ELISA系統較手工法有一定的優點，可適當排除一些非特異因素，減少了一些臨界值上下的數值，提高了試驗數據的穩定性和可靠性。但后續工作中仍需要我們擴大樣本量進行驗證，才能為PBC的診斷和鑒別診斷提供更有價值的實驗室依據。

參考文獻

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(本文編輯：姜敏)

張海萍，閆惠平，張欣，趙丹彤，馬胤雪，孫麗梅，李卓敏

(首都醫科大學附屬北京佑安醫院，北京 100069)

摘要：目的使用全自動酶聯免疫吸附試驗(ELISA)系統檢測抗線粒體M2抗體并探討其臨床意義。方法收集267例血清樣本，包括112例原發性膽汁性肝硬化患者(PBC)、77例乙型肝炎病毒(HBV)感染者和78名健康對照者血清樣本，使用全自動ELISA系統檢測抗線粒體M2抗體，評估該系統檢測抗線粒體M2抗體的精密度和抗線粒體M2抗體的臨床價值。結果全自動ELISA系統的精密度較好，批內和天間的變異系數(CV)均<5%。PBC患者抗線粒體M2抗體的陽性率為89.3%(100/112)，抗體濃度值以大于800 RU/mL為主(63%， 71/112)。HBV感染者抗線粒體M2抗體的陽性率為5.2%(4/77)，3例抗體濃度值在25～100 RU/mL之間，1例在100 RU/mL以上；健康對照組中抗線粒體M2抗體陽性率為5.1%(4/78)，4例抗體陽性者抗體濃度值均在25～50 RU/mL之間。結論抗線粒體M2抗體ELISA檢測的系統化保證了檢驗結果的穩定性，可為PBC的診斷和與其他肝病的鑒別診斷提供更有價值的實驗室依據。

關鍵詞：抗線粒體M2抗體；原發性膽汁性肝硬化；酶聯免疫吸附試驗

Automatic ELISA system for the detection of anti-mitochondrial M2 antibody and its clinical significanceZHANGHaiping，YANHuiping，ZHANGXin，ZHAODantong,MAYinxue,SUNLimei,LIZhuomin.(BeijingYouanHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100069，China)

Abstract:ObjectiveTo detect anti-mitochondrial M2 antibody by automatic enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) system and to investigate its clinical significance. MethodsA total of 267 serum samples[(112 samples from patients with primary biliary cirrhosis (PBC)， 77 samples from patients infected with hepatitis B virus (HBV)and 78 samples from healthy controls] were detected for anti-mitochondrial M2 antibody by automatic ELISA system. The precision and the clinical significance of detecting anti-mitochondrial M2 antibody were evaluated. ResultsThe precision was good .The within-run and inter-day coefficients of variation(CV) were <5%. The patients with PBC had positive rate 89.3% (100/112) for anti-mitochondrial M2 antibody， usually in high levels (>800RU/mL, 63%, 71/112). The positive rate of anti-mitochondrial M2 antibody was 5.2%(4/77)in patients with HBV infection, including 3 cases of 25-100 RU/mL and 1 case of >100 RU/mL, and it was 5.1%(4/78)in healthy subjects. ConclusionsAutomatic ELISA system for the detection of anti-mitochondrial M2 antibody guarantees the stability of results. It will provide valuable laboratory reference for the diagnosis of PBC and the differential diagnosis for other liver diseases.

Key words:Anti-mitochondrial M2 antibody; Primary biliary cirrhosis；Enzyme-linked immunosorbent assay

收稿日期：(2015-02-28)

通訊作者：閆惠平，聯系電話：010-83997348。

作者簡介：張海萍，女，1981年生，碩士，助理研究員，主要從事肝病免疫研究。

基金項目：衛生計生委醫藥衛生科技發展研究中心資助項目(28-5-5)

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)12-1234-04R446.61

文獻標志碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.12.017