化學發(fā)光微粒法檢測抗TP抗體復檢流程探討

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化學發(fā)光微粒法檢測抗TP抗體復檢流程探討

梅毒螺旋體(treponema pallidum,TP)屬于密螺旋體屬蒼白螺旋體的蒼白亞種，是引起人類梅毒的病原體，主要經(jīng)性接觸和輸血傳播，人是梅毒的唯一傳染源。我國TP感染率較高，國內(nèi)學者報道，我國西安地區(qū)159 902名自愿獻血者的檢測結(jié)果顯示，TP陽性率從2006年的0.24%上升到2010年的0.51%[1]。TP在感染人體時具有自然的潛在周期[2]，其診斷依據(jù)主要是血清學試驗。血清學檢測方法包括快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(rapid plasma reagin circle card test，RPR)、TP顆粒凝集試驗(treponema pallidum particle agglutination assay，TPPA)、化學發(fā)光微粒法(chemiluminescence microparticle immunoassay，CMIA)等，其中CMIA檢測抗TP抗體采用原始管上機，敏感性高，特異性好，適合大批量樣本檢測，目前被國內(nèi)大多數(shù)實驗室所使用。但在實際工作中，對于CMIA檢測的信號/臨界值(signal-to-cut off， S/CO)比值≥1.0的樣本都要求進行復檢和確證試驗，造成人力和和試劑的極大浪費。鑒于此，我們統(tǒng)計2012年1月至2014年5月抗TP抗體復檢結(jié)果，以陽性預(yù)測值≥95%為目標，確定初篩試驗的復檢范圍和抗TP抗體臨床檢測操作流程，以期能為臨床合理選擇檢驗項目、正確診斷和治療提供可靠的依據(jù)，同時可減少須進行確證試驗的樣本量。

材料和方法

一、樣本來源

2012年1月至2014年5月三峽大學仁和醫(yī)院住院及門診患者21 894例，年齡11~78歲，其中男10 804例，女11 090例。CMIA初檢S/CO比值≥1.0者630例，其中男352例，女278例。

二、 方法

1.樣本采集用促凝管采集患者空腹靜脈血5 mL，室溫靜置30 min，1 400×g離心10 min后原管上機，在2 h內(nèi)完成檢測，若非當日檢測，樣本可在室溫儲存24 h或在2～8 ℃儲存7 d。

2.檢測方法、儀器和試劑 (1) 抗TP抗體篩查試驗：采用CMIA進行篩查，檢測結(jié)果S/CO比值≥1.0為抗TP抗體陽性反應(yīng)，<1.0為陰性反應(yīng)，i2000SR全自動CMIA分析儀及其配套試劑(美國Abbott公司產(chǎn)品)。(2)抗TP抗體確證試驗：采用免疫印跡法(western blotting，WB)進行CMIA初檢和復檢呈陽性反應(yīng)樣本的結(jié)果驗證，歐蒙醫(yī)學實驗診斷股份公司(德國)生產(chǎn)的抗TP抗體檢測試劑盒，按試劑說明書操作。

結(jié)果

一、初檢S/CO比值≥1.0的樣本CMIA復檢和WB復核結(jié)果

初檢S/CO比值≥1.0的630例樣本與CMIA復檢結(jié)果的總符合率為93.0%(586/630)，與WB結(jié)果的總符合率為75.9%(478/630)。CMIA復檢陽性樣本與WB結(jié)果的總符合率為81.6%(478/586)，凡WB確認陽性的樣本CMIA復檢結(jié)果均呈陽性反應(yīng)。見表1。

表1　初篩呈陽性反應(yīng)的樣本CMIA復檢和WB確證試驗結(jié)果(符合率)　[例(%)]

二、初檢S/CO比值≥1.0的樣本在各初檢S/CO比值區(qū)間內(nèi)CMIA復檢和WB復核結(jié)果

初檢S/CO比值在1.0~6.0范圍的樣本與CMIA復檢結(jié)果的符合率為80.1%(177/221)，CMIA初檢和復檢與WB結(jié)果的符合率分別為45.2(100/221)和56.5%(100/177)。初檢S/CO比值在6.1~8.0范圍的樣本與CMIA復檢結(jié)果的符合率為100.0%(94/94)，CMIA初檢和復檢與WB結(jié)果的符合率均為81.9%(77/94)。初檢S/CO比值1.0~8.0范圍的樣本與CMIA復檢結(jié)果的符合率為86.0%(271/315)，CMIA初檢和復檢與WB結(jié)果的符合率分別為56.2%(177/315)和65.3%(177/271)。初檢S/CO比值≥6.1的樣本與CMIA復檢結(jié)果的符合率為100.0%(409/409)，CMIA初檢和復檢與WB結(jié)果的符合率均為92.4%(378/409)。初檢S/CO比值≥8.1的樣本與CMIA復檢結(jié)果的符合率為100.0%(315/315)，CMIA初檢和復檢與WB結(jié)果的符合率均為95.6 %(301/315)。初檢S/CO比值≥9.1的樣本與CMIA復檢結(jié)果的符合率均為100.0%(230/230)，CMIA初檢和復檢與WB結(jié)果的符合率均為98.3 %(226/230)。見表1。

討論

CMIA檢測抗TP抗體已在國內(nèi)廣泛應(yīng)用，但評價不一。袁明生[3]對CMIA檢測抗TP抗體的試驗進行了評價，指出該方法與熒光抗TP抗體吸收試驗(fluorescent treponemal antibody absorption,FIA-ABS)檢出率相當，可以用于抗TP抗體的篩查，而譚延國等[4]在CMIA與酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和TP血球凝集試驗(treponema pallidum hemagglutination assay, TPHA)檢測抗TP抗體符合情況中發(fā)現(xiàn)，CMIA敏感性較高(接近100%)，重復性好，但特異性較低。雖然國內(nèi)大多數(shù)實驗室遇到抗TP抗體陽性樣本時一般都采用TPPA來確認，但TPPA檢測也存在一定的假陽性率[5]，或CMIA與TPPA聯(lián)合檢測后出現(xiàn)一些抗TP抗體陽性不確定的結(jié)果[6]，出現(xiàn)上述情況可能的原因是由于TPPA與CMIA檢測原理不同，TPPA是用密螺旋體本身作為抗原檢測血清的抗TP抗體，而CMIA采用的是TP15、TP17和TP47這3種經(jīng)典的診斷抗原來檢測，當血清中抗體類型不全時，二者結(jié)果就會出現(xiàn)差異，因此用TPPA作為抗TP抗體的確證試驗存在不足。本研究采用WB做為抗TP抗體確證試驗，WB是目前較為公認的TP特異性抗體確證方法[7]，對梅毒的陽性診斷率達100%，其在試驗操作過程中簡便，陰陽性結(jié)果界線分明，易于判定[8]，但不適合大批量的樣本檢測。

在實際工作中，若對于初檢所有的有反應(yīng)性的樣本都進行復檢并經(jīng)WB確認，勢必會增加成倍的工作量和試劑的浪費。國外學者報道，抗丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)/人類獲得性免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)抗體檢測的S/CO比值與是否需要進一步確證具有相關(guān)關(guān)系，可用S/CO比值的高低來決定是否需要做確證試驗[9]。另一項研究也提示，S/CO比值>均值能夠用來預(yù)測補充確證試驗的陽性結(jié)果[10]。因此，我們借鑒抗HCV抗體和抗HIV抗體篩查試驗程序，探討CMIA檢測抗TP抗體的復檢流程。

CMIA檢測抗TP抗體分析結(jié)果顯示， S/CO比值>8.1以上的樣本315例，與CMIA復檢的符合率為100.0%，與WB的符合率為95.6%。因此，以陽性預(yù)測值≥95%為目標，對于S/CO比值≥8.1的樣本無需CMIA復檢，可直接發(fā)出報告，結(jié)果報告應(yīng)附有未進行旁證試驗的注釋。對于S/CO比值≥8.1結(jié)果的解釋，提示機體既往感染或現(xiàn)在感染TP，未作血清學補充試驗。S/CO比值≥8.1的樣本可報告陽性(陽性預(yù)測值>95%)，但尚有<5%的可能為假陽性，如有需要，可要求進行特異性更好的補充試驗。對于S/CO比值在1.0~8.0范圍的樣本，先經(jīng)CMIA復檢，仍呈陽性反應(yīng)者用WB確認。因其中有假陽性，如果不加以鑒別，發(fā)出報告，可能會產(chǎn)生醫(yī)療糾紛和造成臨床科室對實驗室結(jié)果的不信任。若以陽性預(yù)測值≥98%為目標，則應(yīng)將無需復檢的S/CO比值定為≥9.1，并在檢測報告中作出假陽性率的相應(yīng)提示。另有文獻報道，老年人和某些疾病產(chǎn)生的某些干擾物質(zhì)會影響CMIA的準確性，CMIA測得的呈陽性反應(yīng)的結(jié)果并非都是真陽性，必須通過復檢和/或確證試驗加以鑒別[11]。本研究結(jié)果顯示，我們設(shè)計并提出復檢流程，根據(jù)初檢S/CO比值的范圍選擇復檢試驗，見圖1，對于有條件的實驗室可以選擇WB證實，未開展WB的實驗室，也可以選擇TPPA來初步確認，但對于CMIA與TPPA不相符的結(jié)果，可在報告單備注中說明陽性結(jié)果只提示所測樣本中有抗類脂抗體或抗TP抗體存在，不能作為患者感染TP的絕對依據(jù)，檢測結(jié)果應(yīng)結(jié)合臨床綜合分析。

綜上所述，我們根據(jù)S/CO比值的范圍設(shè)計的復檢流程是建立在陽性預(yù)測值不低于95%的基礎(chǔ)上，故仍有一定的誤診率，尚需大樣本來充實資料并驗證，進一步探索和總結(jié)，優(yōu)化復檢流程，以期為臨床提供更準確的報告。

圖1　建議CMIA檢測抗TP抗體陽性樣本的復檢流程

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(本文編輯：姜敏)

楊華，楊曉東，饒麗華

(三峽大學仁和醫(yī)院檢驗科，湖北 宜昌 443001)

摘要：目的探討化學發(fā)光微粒法(CMIA)檢測抗梅毒螺旋體(TP)抗體的復檢范圍并進行流程改進分析。方法21 894份血清樣本用CMIA篩查抗TP抗體，呈陽性反應(yīng)的樣本用CMIA相同廠家、相同批號的試劑復檢，以免疫印跡法(WB)為確證試驗。以信號/臨界值(S/CO)比值進行分段統(tǒng)計。結(jié)果21 894份血清樣本中CMIA初檢陽性630例，按照CMIA初檢抗TP抗體S/CO比值將樣本分為7組：1.0~2.0、2.1~4.0、4.1~6.0、6.1~8.0、8.1~9.0、9.1~10.0、>10.1。各組CMIA復檢結(jié)果符合率分別為62.5%(40/64)、80.0%(60/75)、93.9%(77/82)、100.0%(94/94)、100.0%(85/85)、100.0%(50/50)和100.0%(180/180)。各組CMIA復檢結(jié)果與WB符合率分別為 35.0%(14/40)、46.7%(28/60)、75.3%(58/77)、81.9%(77/94)、88.2%(75/85)、96.0%(48/50)和98.8%(178/180)。結(jié)論在規(guī)范操作的前提下，以陽性預(yù)測值≥95%為目標，CMIA篩查抗TP抗體的復檢范圍S/CO比值設(shè)定為1.0~8.0，若S/CO比值≥8.1，可直接發(fā)出報告；1.0≤S/CO比值≤8.0，須采用WB確證，這樣既能保證檢驗結(jié)果的準確性，又可減少須進行確證試驗的樣本量。

關(guān)鍵詞：抗梅毒螺旋體抗體；復檢；范圍；化學發(fā)光微粒法；免疫印跡法

Investigation on the retesting procedure of anti-TP antibody determined by chemiluminescence microparticle immunoassayYANGHua，YANGXiaodong，RAOLihua. (DepartmentofClinicalLaboratory，RenheHospitalofChinaThreeGorgesUniversity，HubeiYichang443001，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the retesting range of ani-treponema pallidum (TP) antibody determined by chemiluminescence microparticle immunoassay (CMIA) and improve the retesting procedure. MethodsA total of 21 894 serum samples were screened by CMIA, the positive samples were retested duplicately by the same reagent kit of the same lot number and confirmed by western blotting (WB). The detection results were classifed into several groups for further analysis according to signal-to-cut off (S/CO) ratios. ResultsIn 21 894 serum samples, 630 cases were positive by CMIA. The samples were classified into 7 groups according to S/CO ratios：1.0-2.0, 2.1-4.0, 4.1-6.0, 6.1-8.0, 8.1-9.0, 9.1-10.0 and>10.1. The retesting coincidence rates by CMIA were 62.5%(40/64), 80.0%(60/75), 93.9%(77/82), 100.0%(94/94), 100.0%(85/85), 100.0%(50/50)and 100.0%(180/180).The coincidence rates for retesting by WB and CMIA were 35.0%(14/40)， 46.7%(28/60)，75.3%(58/77)， 81.9%(77/94)， 88.2%(75/85)， 96.0%(48/50) and 98.8%(178/180). ConclusionsThe S/CO ratio for retesting range by CMIA for the determination of anti-TP antibody is considered appropriate from 1.0-8.0 under a standardized laboratory condition and positive predictive value≥95% . Reports can be sent directly with S/CO ratio≥8.1. WB should be employed to confirmation assay with 1.0≤S/CO ratio ≤8.0. The appropriate retesting range not only can assure the accuracy of testing results, but also can reduce the sample numbers of confirmation assay.

Key words:Ani-treponema pallidum antibody; Retesting; Range; Chemiluminescence microparticle immunoassay; Western blotting

收稿日期：(2014-09-16)

作者簡介：楊華，男，1983年生，學士，主管技師，主要從事臨床生化檢驗工作。

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)12-1181-04R446.61

文獻標志碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.12.004