外周血miRNAs檢測在類風濕關節炎中的意義研究進展

劉書中,李子全,李政垚,王以朋

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院 骨科,北京市100730)

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外周血miRNAs檢測在類風濕關節炎中的意義研究進展

劉書中,李子全,李政垚,王以朋*

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院 骨科,北京市100730)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性滑膜炎、進行性骨質破壞和關節功能喪失為特征的自身免疫性疾病，發病率約為1%，好發年齡為35-50歲，女性多于男性[1]。RA的主要病理改變為關節滑膜增厚、大量炎癥細胞浸潤、血管翳形成以及軟骨的侵蝕與破壞，致殘率高，多數患者確診時全身多個關節已出現進行性破壞，預后較差。研究表明RA的發生與基因變異、致病性內外抗原、免疫細胞異常激活及miRNA的異常調節等多種因素有關[2]。目前RA的發病機制尚不明確，深入研究RA分子生物學特征對于RA的診斷和治療具有重要意義。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類在真核生物中發現的長18-25個核苷酸的內源性非編碼小分子單鏈RNA。研究表明miRNA的異常表達與多種疾病的發生、分級分期、耐藥性、預后等密切相關，參與了細胞重要生物學行為的調控,間接地發揮“促癌和抑癌”等功能，miRNAs的深入研究為多種疾病的診斷和治療提供了新思路。影響RA疾病預后的關鍵在于能否早期診斷、自身免疫反應程度和病變累及范圍，研究顯示外周血miRNAs水平與RA的病情進展密切相關，有望成為RA診斷及預后判斷的生物學標記物及治療靶標[3]。鑒于外周血miRNA水平與RA的相關性逐漸被發現并證實，本文就近年外周血miRNA水平在RA診療及預后評估領域的研究進展做一綜述。

1miRNA的分子生物學特征

miRNA生成過程中,編碼miRNA的基因首先在細胞核內轉錄,在RNA聚合酶II的作用下轉錄為幾百至幾千堿基的初級產物(pri-miRNA),pri-miRNA在核內核酸內切酶Drosha酶作用下切割成只含60-70堿基的具有莖-環結構的發夾樣前體(pre-miRNA),pre-miRNA被RNAGTP2依賴的轉運體exportins5轉運至胞漿,在IIIDicer酶(雙鏈RNA專一性內切酶)作用下形成具有雙鏈結構的miRNA,在酶的作用下裂解成22個核苷酸的成熟miRNA與互補鏈miRNA*。而miRNA*立即被降解。

miRNA的主要分子生物學特征包括:(1)通常長度為18-25nt,3’端可以有2-3個nt的變化,長度不定。(2)廣泛存在于真核生物中,不具有開放閱讀框架(ORF,open read frame),不編碼蛋白質。(3)成熟后的miRNA5’端為磷酸基團,3’端是羥基基團,這一特點可以使miRNA與功能性RNA降解生成片段相區分，miRNA通過與靶基因mRNA3’-UTR完全或不完全的互補配對結合,致使靶mRNA降解或翻譯抑制進而調控靶基因的表達,從而影響細胞增殖、侵襲、分化和凋亡等多種生物學行為。(4)miRNA在多種種屬中的表達具有保守性。(5)miRNA的表達具有時序性和組織特異性。miRNA的保守性、時序表達特異性和組織表達特異性提示其在生命活動的微觀層面發揮重要作用[4]。

miRNA的功能由RNA所介導的沉默復合物(RNA-induced silencing complex,RISC)介導,最終引起蛋白質翻譯受抑或者同源mRNA降解等生物過程[5]。大量研究顯示miRNA可調節人類近60%的蛋白編碼基因,miRNA與靶mRNA并非完全互補配對,平均每個miRNA可以直接調節人類200種不同的mRNA,多個miRNA可以協同調節某些特殊靶基因,多個miRNAs也可能共同調節同一基因靶點,這種協同調節模式形成復雜的調控網絡，因此每一個miRNA的異常表達都有可能導致大量蛋白質的表達異常[6,7]。

2外周血miRNA檢測在類風濕關節炎診斷、治療及預后評估中的意義

2.1miRNA在外周血中的表達及檢測方法

外周血miRNA可能來源于凋亡壞死腫瘤細胞、血細胞、巨噬細胞的裂解等。最新研究顯示外周血miRNA可能來自組織細胞的主動分泌過程，成熟的miRNA在細胞內被脂蛋白包被成外切酶體分泌至細胞外，最終到達血液。由于大多數miRNA是由細胞分泌的，組織細胞中miRNA與循環miRNA必然有一定的聯系。研究結果表明miRNA在組織和體液中具有相同的改變趨勢[8]。實驗表明外周血中RNA在室溫下過夜、反復凍存、解凍、煮沸、過酸或過堿等惡劣情況下可以維持穩定，進一步證實了循環miRNA替代組織活檢而成為新型生化指標的可能。

目前檢測miRNA的方法有克隆測序、Northern印記雜交、原位雜交、基因芯片、實時定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)等[9]。其中應用最廣泛的是qRT-PCR技術，能區分miRNA前體和成熟體，只定量具有生物活性的成熟miRNA，可精確區分同一家族中序列高度同源的miRNA，能檢測只有一個堿基差別的不同miRNAs表達水平，靈敏度和特異度高，樣品消耗量少，只需要l-l0ngRNA即能檢測出低豐度靶miRNA，定量線性范圍寬，有著在臨床檢測領域大規模推廣的潛力。

2.2外周血miRNAs檢測在RA中的意義

2.2.1外周血miR-16檢測在RA中的意義Murata等[10]采用qRT-PCR技術檢測RA患者、骨關節炎患者及健康對照者血漿及關節滑液中miR-16，miR-132，miR-146a，miR-155及miR-223表達水平。研究發現健康對照組血漿miR-132水平較RA組和OA組顯著升高，其具有診斷意義。RA組關節滑液中miR-16、miR-146a、miR-155、miR-223濃度較OA組顯著升高，可能與局部炎癥刺激有關，并且血漿miR-16與miR-146a水平與疼痛關節數(tender joint count，TJC)和DAS28(28-joint Disease Activity Score)呈顯著負相關，結果提示血漿miR-16表達水平可以作為RA活動的分子標志，血漿miRNAs表達水平對RA發病機制闡明及診療具有重要價值。此外，有研究表明血漿miRNA數量或miRNA在滑膜液和血漿中的比例與關節損傷程度密切相關。Wang等[11]應用qRT-PCR技術研究發現RA患者外周血miR-16、miR-21、miR-451、miR-223表達水平顯著升高。孫寅等[12]研究表明miR-16 在血漿中的表達水平顯著高于關節滑液以及外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)(P<0.01)，上調變化倍數分別為8.7倍和9.6倍，miR-16在關節滑液中的表達水平高于PBMC，上調變化倍數為1.5倍，無統計學意義(P>0.05)，miR-16在RA患者血漿中的表達水平低于正常健康人，下調變化倍數為0.65倍，無統計學意義(P>0.05)，miR-16在RA患者PBMC中的表達水平顯著高于正常健康人(P<0.01)，上調變化倍數為1.9倍。研究還證實血漿miR-16的表達與DAS28評分呈負相關(P<0.05)，與年齡、性別、病程、紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation tate，ESR)及C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)均無關(P>0.05)，PBMC中miR-16的表達與DAS28評分、ESR 及CRP呈正相關(P < 0.05)，與年齡、性別及病程無關(P> 0.05)。研究證實檢測miR-16在外周血中的表達可為臨床對RA與OA進行鑒別診斷以及深入探索RA的發病機制提供新的思路，血漿miR-16的表達水平有望成為評價RA 病情活動度的有效指標。鄭錫銘等[13]檢測80例RA患者、32例骨關節炎(OA)患者及32例健康對照者血漿、PBMC及關節液miR-16的表達量，并與RA活動性監測指標類風濕因子(RF)、ESR、CRP進行相關性分析，結果顯示RA組血漿、PBMC和關節液中miR-16相對于OA組、健康對照組表達上調(P<0.05)，血漿miR-16水平與一個或多個RA活動性監測指標呈正相關(P<0.05)。此外，Hanson等[14]首次指出miRNA 圖譜可作為法醫體液鑒定的方法，并發現在死亡機體的外周血及其它體液中幾乎都能檢測到452種miRNA，但這452種miRNA在不同體液中的表達量不同。其中外周血miR- 16能在含量僅為50pg的條件下被檢測鑒別出來。

2.2.2外周血miR-146a檢測在RA中的意義研究表明miR-146a功能缺陷是導致TNF-α在RA患者體內持續表達的重要原因，miR-146a可通過下調IRAK1的表達抑制滑膜成纖維細胞增殖及IL-6、IL-8等炎性細胞因子的分泌，從而發揮抑制RA滑膜炎癥的作用。馮知濤等[15]應用qRT-PCR技術檢測RA患者活動組24例、緩解組16例及健康對照16例PBMCs中miR-146a、miR-16表達水平，并與RA患者臨床指標進行相關性分析，結果顯示RA組miR-146a、miR-16的表達高于健康對照組(P<0.05)，在RA活動組與緩解組的比較中發現活動組miR-146a、miR-16表達水平高于緩解組(P<0.05)。RA組miR-146a、miR-16的表達與ESR、CRP及DAS28評分之間呈正相關(P<0.01)，與RF無相關性(P>0.05)。研究證實RA患者外周血miR-146a和miR-16表達上調，其表達水平與RA病情活動相關，提示miR-146a和miR-16的檢測可作為RA病情活動的判斷指標。高登文等[16]也通過研究證實RA 患者PBMC中miR-146a表達上調，其表達水平與RA病情活動程度有關。劉琴等[17]用SYBR Green I qRT-PCR檢測RA患者48例(活動期30例，緩解期18例)、骨性關節炎患者22例和體檢健康者25例血清miR-146a的表達水平，并進行ROC曲線分析，對各組進行ESR檢測，結果表明活動期RA患者血清miR-146a相對表達水平為(2.42 ±0.75)，顯著高于緩解期RA患者(1.66±0.29)、OA患者(1.12±0.43)和體檢健康者(1.01±0.34 )，差異均有統計學意義(P<0.05)。miR-146a診斷活動期RA的ROC曲線下面積為0.914 (95%CI：0.872-0.926)，以1.96為臨界值，敏感性為95.0%，特異性為87.5%，準確性為91.9%，研究結果表明血清miR-146a水平可用于診斷活動期RA。

2.2.3外周血miR-155檢測在RA中的意義Ormseth等[18]采用qRT-PCR技術分析RA患者血漿中7種miRNA表達水平，結果發現RA患者血漿中miR-155-5p、miR-15a-5p、miR-24-3p、miR-26a-5p、miR-125a-5p、miR-146a-5p及miR-223-3p表達水平均顯著升高，其中miR-24-3p診斷RA準確率最高(AUROC=0.725)，研究還證實聯合檢測血漿miR-24-3p、miR-26a-5p和miR-125a-5p水平診斷RA準確率最高 (AUROC=0.747)，血漿miR-155-5p水平與關節腫脹評分相關(P=0.024)，血漿中7種miRNA表達水平與疾病活動度及心血管風險無顯著相關性。Kaleb等[19]的實驗顯示在PBMC中RA患者miR-146a、miR-155、miR-132、miR-16的含量分別是健康對照組的2.6、1.8、2.0、1.9 倍，但miR-let-7a的表達在RA與健康對照組間差異無統計學意義。荀春華等[20]采用qRT-PCR檢測隨機選取的43例RA患者和30例健康體檢者血漿和PBMC中四種miRNAs(miR-146a、miR-223、miR-16和miR-155)的表達，結果表明與對照組相比，RA組患者血漿中miR-146a和miR-155表達下調(P<0.05)，PBMC中四種miRNAs表達均上調(P < 0.05)，相關性分析顯示四種miRNAs在血漿和PBMC中的表達沒有明顯相關性。

2.2.4外周血miR-223檢測在RA中的意義Carmen等[21]選取95例RA患者，分析納入對象經抗TNF-α/改良抗風濕藥物(抗TNF-α/DMARDs)聯合治療后血清miRNA水平變化，研究表明經抗TNF-α/DMARDs聯合治療后血清miR-16-5p，miR-23-3p，miR-125b-5p，miR-126-3p，miR-146a-5p，miR-223-3p水平顯著升高，此外研究還證實血漿miR-23與miR-223水平也可作為判斷抗TNF-α/DMARDs聯合治療效果的新型生化指標。Mária等[22]檢測RA早期(ERA)患者、RA確診患者及健康對照者血清miR-146a、miR-155、miR-223、miR-16等表達水平，結果表明RA早期患者miR-146a、miR-155和miR-16水平較RA確診患者顯著升高，治療3個月期間循環miR-16水平變化與RA早期患者DAS28評分改變密切相關(P=0.002)，治療期間循環miR-223水平與C反應蛋白(P=0.008)、DAS28評分(P=0.031)、治療3月后DAS28評分(P=0.003)及治療12月后DAS28評分(P=0.011)密切相關，但在本研究中血清miR-16與miR-223水平不能區分ERA患者與健康對照者。該研究證實miR-16與miR-223可反映ERA疾病活性并預測疾病進展。

2.2.5其他外周血miRNAs檢測在RA中的意義Geoffrey等[23]采用基因芯片及qRT-PCR技術證實miR-595和miR-1246在RA患者血清中表達水平顯著升高(P=0.024，P=0.036)，并可作為RA疾病診療的新型生化指標。Isabelle等[24]應用qRT-PCR技術檢測48例RA患者、7例骨關節炎患者及13例健康對照者全血和血清中miR-125b表達水平，研究發現在RA疾病發作期血清miR-125b水平與3月后利妥昔單抗臨床治療RA的效果呈正相關(P=0.002)，其血清表達水平可作為判斷利妥昔單抗治療效果較好的預測指標。Murata等[25]檢測并驗證了113例RA患者及115例健康對照者血漿miRNAs水平，結果顯示miR-125a-5p、miR-24、miR-26a對RA疾病診斷具有重要價值(AUC=0.83、0.80、0.80)，并且在抗瓜氨酸蛋白抗體(ACPA)陽性及陰性患者中表達水平無顯著差異。Krintel等[26]選取89例阿達木單抗40 mg治療患者與91例安慰組對照患者并檢測377種外周血miRNA表達情況，研究發現外周血miR-22低表達與miR-886.3p高表達提示RA患者應用阿達木單抗治療效果較為理想，聯合二者預測RA患者阿達木單抗治療效果尚需進一步研究。Yang等[27]采用qRT-PCR技術分析RA患者血清及滑液中miR-221表達水平，研究結果顯示RA患者血清及滑液中miR-221表達水平顯著高于健康對照組，miR-221表達下調可顯著抑制促炎細胞因子及趨化因子的表達。

3結語及展望

外周血中多種miRNAs在類風濕關節炎中均有異常表達，并且其水平隨著RA病情進展而相應改變。多項研究表明外周血miRNA水平可作為RA診斷、病情進展及預后評估的新型生化指標，并有望為RA的治療提供新的靶點。

近年來，針對miRNA的研究已成為國際上熱點研究內容之一，對外周血中miRNA的研究也逐漸開展，但目前miRNA的臨床相關研究還缺乏大樣本、多中心的數據論證。由于miRNA作用的多重性，使有關外周血miRNA的研究方向得以不斷擴展。但其特異性作用機制等尚需進一步探討，以期早日應用于臨床。隨著研究內容不斷深入，外周血miRNAs檢測將在RA的早期診斷、鑒別診斷、治療及預后判斷等諸多方面展現出更為廣泛的應用前景，并且為RA的診斷、治療及預后評估起到推動作用。

參考文獻：

[1]Gibofsky A.Epidemiology,pathophysiology,and diagnosis of rheumatoid arthritis:A Synopsis[J].Am J Manag Care，2014,20(7 Suppl):S128.

[2]Yamamoto K,Okada Y,Suzuki A,et al.Genetic studies of rheumatoid arthritis[J].Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci，2015,91(8):410.

[3]Chen XM,Huang QC,Yang SL,et al.Role of Micro RNAs in the Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis:Novel Perspectives Based on Review of the Literature[J].Medicine (Baltimore)，2015,94(31):e1326.

[4]Mishra PJ.MicroRNAs as promising biomarkers in cancer diagnostics[J].Biomark Res，2014,2:19.

[5]Melo SA,Sugimoto H,O'Connell JT,et al.Cancer exosomes perform cell-independent microRNA biogenesis and promote tumorigenesis[J].Cancer Cell，2014，26(5):707.[6]Kobayashi E,Satow R,Ono M,et al.MicroRNA expression and functional profiles of osteosarcoma[J].Oncology，2014，86(2):94.

[7]Makarova JA,Shkurnikov MU,Turchinovich AA,et al.Circulating microRNAs[J].Biochemistry (Mosc)，2015,80(9):1117.

[8]Cappelletti V,Appierto V,Tiberio P,et al.Circulating Biomarkers for Prediction of Treatment Response[J].J Natl Cancer Inst Monogr，2015,2015(51):60.

[9]Urbanek MO,Nawrocka AU,Krzyzosiak WJ,et al.Small RNA Detection by in Situ Hybridization Methods[J].Int J Mol Sci，2015,16(6):13259.

[10]Murata K,Yoshitomi H,Tanida S,et al.Research article Plasma and synovial fluid microRNAs as potential biomarkers of rheumatoid arthritis and osteoarthritis[J].Arthritis Res Ther，2010,12(3):R86.

[11]Wang H,Peng W,Ouyang X,et al.Circulating microRNAs as candidate biomarkers in patients with systemic lupus erythematosus[J].Transl Res，2012,160(3):198.

[12]孫寅.miRNA-16在類風濕性關節炎患者血漿和關節滑液中的表達及臨床意義[D].石家莊:河北醫科大學,2012.

[13]鄭錫銘,劉鑫,周林林,等.6種miRNAs在類風濕關節炎患者外周血及關節液中的表達分析[J].中國免疫學雜志,2014,12(30):1686.

[14]Hanson EK,Lubenow H,Ballantyne J.Identification of forensically relevant body fluids using a panel of differentially expressed microRNAs[J].Anal Biochem，2009,387(2):303.

[15]馮知濤,李娟,任潔,等.類風濕關節炎患者外周血miR-146a及miR-16的表達及與病情活動的相關性研究[J].南方醫科大學學報,2011,31(2):320.

[16]高登文.miR-146a、IRAK1基因多態性和miR-146a的表達在類風濕關節炎中的意義[D].合肥:安徽醫科大學,2012.

[17]劉琴,王偉,張仙珍.SYBR Green I熒光定量PCR檢測類風濕關節炎患者血清miR-146a的表達及意義[J].臨床檢驗雜志,2014,32(6):422.

[18]Ormseth MJ,Solus JF,Vickers KC,et al.Utility of Select Plasma MicroRNA for Disease and Cardiovascular Risk Assessment in Patients with Rheumatoid Arthritis[J].J Rheumatol，2015,42(10):1746.

[19]Kaleb M Pauley,Minoru Satoh,Annie L Chan,et al.Upregulated miR-146a expression in peripheral blood mononuclear cells from rheumatoid arthritis patients [J].Arthritis Research and Therapy，2008,10(4):R101.

[20]荀春華,胡志堅,韓峰.四種循環miRNA在類風濕性關節炎患者血漿及外周單個核細胞中的表達分析[J].國際檢驗醫學雜志,2013,34(15):1943.

[21]Castro-Villegas C,Pérez-Sánchez C,Escudero A,et al.Circulating miRNAs as potential biomarkers of therapy effectiveness in rheumatoid arthritis patients treated with anti-TNFα[J].Arthritis Res Ther，2015，17:49.

[22] Filková M,Aradi B,Senolt L,et al.Association of circulating miR-223 and miR-16 with disease activity in patients with early rheumatoid arthritis[J].Ann Rheum Dis，2014,73(10):1898.

[23]Krissansen GW,Yang Y,McQueen FM,et al.Overexpression of miR-595 and miR-1246 in the sera of patients with active forms of inflammatory bowel disease[J].Inflamm Bowel Dis，2015,21(3):520.

[24]Duroux-Richard I,Pers YM,?Fabre S,et al.Circulating miRNA-125b is a potential biomarker predicting response to rituximab in rheumatoid arthritis[J].Mediators Inflamm，2014,[Epub ahead of print]

[25]Murata K,Furu M,Yoshitomi H,et al.Comprehensive microRNA analysis identifies miR-24 and miR-125a-5p as plasma biomarkers for rheumatoid arthritis[J].PLoS One，2013,8(7):e69118.

[26]Krintel SB,Dehlendorff C,Hetland ML,et al.Prediction of treatment response to adalimumab:a double-blind placebo-controlled study of circulating microRNA in patients with early rheumatoid arthritis[J].Pharmacogenomics J，2015,[Epub ahead of print]

[27]Yang S,Yang Y.Downregulation of microRNA221 decreases migration and invasion in fibroblastlike synoviocytes in rheumatoid arthritis[J].Mol Med Rep，2015,12(2):2395.

*通訊作者

文章編號：1007-4287(2016)07-1212-04

(收稿日期：2015-08-12)