關于藍莓花青素提取及其抗氧化活性的分析

孫 莉

（呼倫貝爾市食品藥品監督管理局執法稽查支隊 內蒙古 海拉爾 021008）

引言

藍莓花青素是藍莓鮮果中最為主要的活性成分，在實際研究分析時，因藍莓花青素比較容易氧化，所以，國內外研究并未形成統一的定性以及定量測定方法。首先，針對花青素的定量測試方法主要包括正丁醇-鹽酸法、香草酸-鹽酸法、香草酸-硫酸法等。其中，花青素結構對正丁醇-鹽酸法受的影響比較大，在這種情況下，不適合測定低聚合度花青素。香草酸-鹽酸法在測定花青素含量較低的提取物水溶液時，體系透明度較低；干擾較大香草酸硫酸法時，由于硫酸的強氧化作用使得測定結果偏低。其次，定性方法包括紅外吸收光譜法、高效液相色譜法(HPLC)等。其中，HPLC既可以對花青素定性也可以對花青素定量。基于此， 應利用此方法進行藍莓中的花青素提取以及抗氧化活性分析。

一、藍莓的生物活性物質

實驗證明，藍莓的果實與葉子均能夠入藥，其果實藥性酸、甘、平，能夠有效防止痢疾，葉片則性比較苦、澀、溫，且有小毒，能夠起到利尿、解毒的功效。藍莓果實中包含大量的花色苷以及多酚類抗氧化活性成分，能夠對人體內的自由基進行有效清除，起到預防癌癥的作用。需要說明的是，藍莓果實中包含豐富的果膠，藍莓花色苷對血栓形成有良好的預防效果，進而能夠降低心血管的發病幾率。藍莓花青素利用視網膜紅色素的增加進而舒緩眼部疲勞，對人眼睛的機能能夠有效改善，可以起到預防白內障的作用。藍莓還可以起到延緩腦神經衰老的作用。再就是，藍莓果實因其維生素含量比較豐富，因而能夠起到促進創傷和骨折愈合的功效，提升機體免疫力。

二、藍莓花青素提取與分析

（一）實驗儀器和材料

1.實驗材料

選取鄂倫春地區藍莓鮮果若干；藍莓花青素則通過實驗室來加以制備；矢車菊素標準品，歐洲藥典(EP)對照品，CAS號：528-58-5。

2.儀器與試劑

（1）儀器

微波合成萃取儀；DS-1型高速組織搗碎；色譜柱：KromasilRP-C18柱，合肥馬伊娜分析儀器有限公司。

（2）試劑

對于新型“被XX”結構中“被”的歸屬問題各家說法不一，主要有助詞/助動詞說、否定標記說、類詞綴說、副詞說。除副詞說認為“被”是實詞外，其他幾種說法都認為“被”是虛化程度較高的成分。

丙酮、乙腈、甲酸等試劑均為國產分析純

（二）實驗方法

1.原料預處理

選取若干藍莓樣品，其中，需要去除未成熟抑或出現破碎的樣品，將選取的樣品放至低溫冰箱(溫度為-20°C)中保存，使用時才取出，并用組織搗碎機搗成勻漿備用。

2.丙酮浸提法

（1）丙酮濃度對花青素提取效果的影響

稱取五份重量為5.0g的藍莓漿液，分別加入50%、60%、70%、80%、90%的丙酮溶液，料液比為1：4。在4°C的恒溫水浴中封口振蕩1.5小時后，加以過濾，以紫外-可見分光光度計在最大吸收波長下測定吸光度，確定最佳提取液濃度。

（2）提取溫度對花青素提取效果的影響

稱取四份重量為5.0g的藍莓漿液，分別加入濃度為70%的丙酮溶液，料液比為1：4，分別在0°C、4°C、15°C、25°C下水浴中封口振蕩1.5小時后，加以過濾，以紫外-可見分光光度計在最大吸收波長下測定吸光度，確定最佳提取溫度。

稱取四份重量為5.0g的藍莓漿液，分別加入濃度為70%的丙酮溶液，料液比為1：4，在4°C的水浴中分別封口振蕩0.5h、1h、1.5h、2h，加以過濾，以紫外-可見分光光度計在最大吸收波長下測定吸光度，確定最佳提取時間。

（4）料液比對花青素提取效果的影響

由圖1可知，料液比為1：3時，花青素提取率最高。隨著料液比的增大，提取得到的花青素含量也逐漸增加，當料液比為1：3時，提取率達到最大。當料液比大于1：3時，溶液中水的體積也增大，使水中吸附更多的氧，部分花青素因而被氧化，導致花青素含量降低。

圖1 料液比對花青素提取率的影響

3.藍莓花青素提取最佳條件

為了尋找藍莓花青素的最佳提取條件，本試驗對丙酮濃度、提取溫度、提取時間、料液比4 個因子設計了 正交試驗組合表( 見表1)。

實驗結果表明，各因素對測定結果的影響次序為：提取溫度>丙酮濃度>提取時間>料液比，從而得出最佳提取工藝是：70%兩酮，提取溫度為4℃，提取時間為1.5h，料液比為1：3。

三、藍莓花青素的抗氧化活性分析

（一）實驗內容

1.DPPH自由基的清除實驗

圖2 花青素對DPPH自由基的清除作用

表1 正交實驗結果

由圖2可知，藍莓花青素和VC對DPPH自由基的清除率與它們的濃度存在劑量效應關系，且與藍莓花青素和VC的濃度呈正相關性，并且在測定濃度范圍內(5-25μg/mL)，表現出了清除率與濃度呈線性關系。清除 DPPH活性大小為：藍莓花青素>VC。根據上圖可以計算出，藍莓花青素對DPPH的清除能力的IC50約為11.5μg/mL，而VC對DPPH的清除能力的IC50約為14.2μg/mL。抑制濃度越小，則表明清除 DPPH 的能力越強，因此，藍莓花青素對DPPH 的清除能力強于VC。

圖3 花青素對HO 自由基的清除作用

2.HO自由基清除實驗

由圖 3可知，藍莓花青素具有較強的清除羥基自由基的能力。并且在測定濃度范圍內(0.1-0.5rng/mL)，清除能力隨濃度增大而增強，并呈現出較好的線性關系。在低濃度時，藍莓花青素和VC對HO的清除能力比較接近；隨著濃度的增大，兩種物質對HO的清除能力相差越來越大。濃度相同時，對HO的清除能力大小為：藍莓花青素>VC。據此可知，藍莓花青素對HO的清除能力的IC50約為0.28mg/mL，而VC對HO的清除能力的IC50約為0.36 mg/mL，表明：藍莓花青素對HO的清除能力強于VC。

圖4 花青素對O2-自由基的清除作用

3.超氧陰離子自由基(O2-)的清除實驗

由圖4可知，藍莓花青素和VC對O2-自由基都有一定的清除作用。在實驗的 l0μg/mL-50μ g/mL濃度范圍內，隨著藍莓花青素和VC濃度的升高，其清除作用也越明顯，并且濃度與清除率之間具有較好的線性關系。據此可知，藍莓花青素對 O2-自由基的清除能力的 IC50約為 29.34μ g/mL，而VC對O2-自由基的清除能力的IC50約為34.65μg/mL，表明：藍莓花青素對O2-自由基的清除能力強于VC。

（二）藍毒花青素抗氧化性能的研究

花青素類化合物對多種自由基都具有較強的捕捉能力。藍莓花青素的抗氧化能力可以通過多種途徑來表現，例如:通過與 O2-反應，來抑制活性氧自由基的作用；通過整合金屬離子，來減少金屬離子對氧化反應的催化作用；還具有阻止脂質過氧化反應。

本實驗測定藍莓花青素對DPPH自由基、HO自由基和超氧陰離子自由基(O2-)的清除能力。DPPH是一種很穩定的自由基，它的顏色減退程度與清除劑的清除能力及數量呈定量關系。該方法穩定性好、靈敏度高，被廣泛應用于評價抗氧化物質的抗氧化能力；HO自由基和超氧陰離子自由基(O2-)在生命過程中會不斷產生，是最具有代表性的自由基。而且HO自由基的氧化能力很強，能發生電子轉移，且反應速度最快，對機體的損傷也最大；超氧陰離子自由基(O2-)的形成時間最早，它的危害性僅次于HO自由基。

四、小結

藍萄花青素的抗氧化能力很強。藍莓花青素能明顯抵抗DPPH自由基、HO自由基和超氧陰離子 O2-自由基，并且藍莓花青素對這三種物質的清除率均與花青素濃度呈線性關系。在實驗的濃度范圍內，藍莓花青素對 DPPH自由基的最大清除率可達69.8%，對HO自由基的最大清除率可達74.8%，對超氧陰離子O2-自由基的最大清除率可達77.6%。而且，藍莓花青素的抗氧化能力高于同等濃度下的VC。